冠突散囊菌发酵对茶汤香气成分的影响

郑梦霞，李会娟，陈淑娜，赵 真，刘馨秋，黎星辉，陈 暄*

（南京农业大学茶叶研究所，江苏 南京 210095）

摘 要：为探讨冠突散囊菌（Eurotium cristatum）发酵对茶叶提取液香气成分的影响，利用冠突散囊菌对中低档绿茶和红茶提取液进行发酵，采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱法分别检测审评用样品以及提取、灭菌和发酵后样品的香气成分，分析香气成分的变化规律。结果表明，绿茶与红茶提取液经冠突散囊菌发酵新产生苯甲酸甲酯、异佛尔酮、对甲氧基苯乙烯、对乙基苯甲醛、香叶酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯6 种化合物。同时，绿茶茶汤经冠突散囊菌发酵后，芳樟醇、芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、苯乙酸甲酯、α-松油醇、反-2-癸烯醛和α-紫罗酮分别增长了1.30、2.15、2.04、0.29、3.18、0.10 倍和2.08 倍，且香气种类与含量均上升。但红茶茶汤经冠突散囊菌发酵后大部分香气物质含量下降，其中苯乙醇、反-2-壬烯醛、2-苯基巴豆醛、顺柠檬醛、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、月桂醛、肉豆蔻醛等未检出，表明冠突散囊菌发酵红茶会带来香气总量的损耗，与红茶相比，低档绿茶更适合使用冠突散囊菌开发发酵型饮料。

关键词：冠突散囊菌；低档茶；液体发酵；香气成分；气相色谱-质谱法

香气是茶叶的重要品质因素，茶叶中的芳香物质即挥发性香气成分，是茶叶中所有易挥发性物质的总称。不同的栽培技术和加工工艺造就了不同类型的茶叶拥有其独特的香气特征[1-4]。

冠突散囊菌（Eurotium cristatum），俗称“金花菌”，是茯砖茶独特的“发花”工艺中的一种优势益生菌[5-6]。经过“发花”工艺后的茯砖茶表面均匀地分布着冠突散囊菌产生的黄色闭囊壳——“金花”，而“金花”的数量和质量常被人们视作茯砖茶品质优劣判定的标志。茯砖茶的独特保健功能，不仅与黑毛茶本身含有的功能成分相关，而且更与茯砖茶“渥堆”、“发花”过程中因微生物代谢而产生的生物活性成分相关[7-9]，因此发花过程形成的“金花菌”对茯砖茶保健功能的形成起着特殊的作用，是决定茯砖茶品质的关键因素。香气也是构成茯砖茶独特品质的重要因子，渥堆发酵过程中，由于冠突散囊菌等微生物形成的胞外酶与茶叶本身湿热作用的协同下，形成茯砖茶典型独特的“菌花香”香气特征[10]。

应用冠突散囊菌制备发酵型茶饮料，可以有效地利用液体发酵工艺进行工业化生产，具备产量高、培养周期短、易于标准化等优点，并可以促进低档茶的增值开发利用。目前，针对冠突散囊菌液体发酵茶汤、发酵条件的优化以及发酵过程中生化成分的动态变化等均有研究，表现为多酚、儿茶素、咖啡碱等成分含量的降低，酯型儿茶素的转化等[11-14]，但对香气在此过程中的变化研究较少，多使用“菌花香”描述[15]，目前对茯砖茶香气的种类有所研究[16-19]，但茯砖茶为固体发酵，过程较长，参与的微生物种类较多，环境湿热对香气物质也有较大影响，冠突散囊菌发酵产生的新增芳香物质及其物质基础鲜见报道。

本实验仅利用冠突散囊菌作为唯一菌种对中低档绿茶和红茶浸提液进行液体发酵，采用顶空固相微萃取法结合气相色谱-质谱法鉴定茶叶审评样、浸提液灭菌样以及发酵前后的香气成分，分析香气成分的变化，探索冠突散囊菌对绿茶及红茶香气成分的影响，以期为茯砖茶香气品质形成机理及发酵类茶饮料的增香技术研究提供理论依据，为解决中低档茶叶出路寻找有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冠突散囊菌由湖南益阳茶厂生产的茯砖茶中分离得到并鉴定，保存于4 ℃冰箱。绿茶（二级炒青绿茶）、红茶（二级工夫红茶）均购于南京苏果超市。葡萄糖、琼脂、蔗糖均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

20 mL顶空萃取瓶 上海安普公司；手动固相微萃取进样手柄、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯萃取头美国Supelco公司；450-GC 320-MS气相色谱-质谱联用仪德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 冠突散囊菌的活化培养

取冠突散囊菌种，置于28 ℃恒温培养箱中活化24 h，挑取菌丝体在马铃薯葡萄糖培养基（potato dextrose agar，PDA）斜面上划线，然后放置到28 ℃恒温培养箱中培养4 d。

1.3.2 冠突散囊菌孢子悬液的制备

取活化后试管，在无菌操作条件下，倒入无菌水10 mL，用接种环将黄色闭囊壳刮下，悬浮于无菌水中，再将悬浮液倒入玻璃珠的锥形瓶中，振摇20 min，将其OD600值调整用于接种（孢子浓度为5.0×108～6.0×108 CFU/mL）。

1.3.3 茶叶浸提液的制备

审评样制备：按照GB/T 23776—2018《茶叶感官审评方法》，取3.0 g茶样，加入150 mL沸水，5 min后取样。

提取样制备：按照茶水比1∶30（g/mL）称取一定量预先磨碎的茶叶试样于锥形瓶中，加入蒸馏水后立即移入沸水浴，浸提45 min（每隔10 min搅拌一次），立即减压过滤，残渣用少量蒸馏水洗2～3 次，合并滤液加蒸馏水定容备用。添加6%的蔗糖，调整初始pH值至5.5，混匀后分装，灭菌（121 ℃，30 min）。

1.3.4 冠突散囊菌液体发酵培养

在250 mL锥形瓶中装入上述茶汁发酵培养基100 mL，接入冠突散囊菌孢子悬液1 mL（即接种量为1%），在30 ℃、120 r/min条件下恒温振荡培养，每个平行设3 个重复。

1.3.5 绿茶和红茶提取液冠突散囊菌发酵前后香气成分的测定

1.3.5.1 香气成分的提取（顶空固相微萃取法）

分别取12 mL样品装入20 mL萃取瓶中，然后将装有萃取头的手动进样器插入萃取瓶的顶空部分（注意避免萃取纤维头接触样品），在磁力搅拌条件下60 ℃萃取60 min，完成萃取后，迅速插入气相色谱进样口，250 ℃解吸5 min[20-22]。

1.3.5.2 色谱条件

色谱柱：BR-5MS毛细管色谱柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；检测器温度250 ℃；载气：高纯氦气（纯度＞99.999%）；流速1 mL/min；升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至210 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至250 min，保持5 min；不分流进样。

1.3.5.3 质谱条件

电子电离源；转接口温度280 ℃；进样口温度250 ℃；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；质量扫描范围40～500 u。

1.3.6 谱图分析

定性分析：由气相色谱-质谱分析得到的质谱数据通过计算机在NIST标准谱库的检索及参照已发表的质谱资料，对化合物进行定性分析，鉴定。

定量分析：用峰面积表示各成分的含量。

2 结果与分析

2.1 绿茶提取液冠突散囊菌发酵前后挥发性组分特征

从绿茶原料中共检测出58 种化合物（表1），其中含量最高的10 种成分分别为壬醛、芳樟醇、邻苯二甲酸二异丁酯、硬脂酸、棕榈油酸、L-香芹醇、植酮、橙花醇、β-环柠檬醛、吲哚。通过对香气类型进行分析发现（表2），醇类7 种、醛类8 种、酮类7 种、酸类5 种、酯类9 种、碳氢化合物12 种、其他10 种。含量最高的是醇类，占香气总量的19.3%，其次是醛类、酸类、酯类、酮类，各占18.5%、15.9%、15.8%、10.8%和12.1%。这些挥发性成分构成了绿茶原料的香气特征。

由表1可以看出，浸提和灭菌对绿茶香气的影响很大。香气物质种类显著减少，浸提后由58 种减少到26 种，灭菌后的绿茶浸提液仅检测出11 种挥发性物质。绝大部分能检测到的香气物质含量也显著减少，其中酸类物质变化最大，浸提以及灭菌后的浸提液未能检测出任何酸类物质。

经过冠突散囊菌发酵后的绿茶浸提液中共检测到38 种化合物（表1），其中含量较高的10 种香气物质分别为对甲氧基苯乙烯、芳樟醇、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、香叶酸甲酯、芳樟醇氧化物I、α-松油醇、2,5-二叔丁基酚、咖啡碱、邻苯二甲酸二异丁酯、β-大马士酮。部分浸提和灭菌后消失的香气组分经过冠突散囊菌发酵后再次出现，包括芳樟醇氧化物I、芳樟醇氧化物II、癸醛、β-环柠檬醛、反-2-癸烯醛、2-甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、顺茉莉酮、α-紫罗酮、植酮等。同时发酵后的浸提液新检测出10 种化合物，分别为苯甲酸甲酯、异佛尔酮、对甲氧基苯乙烯、对乙基苯甲醛、香叶醇、香叶酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、β-大马士酮、2,2,4-三甲基-1,2-二氢呋喃。7 种化合物在发酵后与原料相比含量增加，芳樟醇为原料的2.30 倍，芳樟醇氧化物I为3.15 倍，芳樟醇氧化物II为3.04 倍，苯乙酸甲酯为1.29 倍，α-松油醇为4.18 倍，反-2-癸烯醛为1.10 倍，α-紫罗酮为3.08 倍。发酵后与原料相比含量减少的有壬醛、藏花醛、癸醛、β-环柠檬醛、2-甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、顺茉莉酮、β-紫罗酮、肉豆蔻醛等，以醛类居多。

表1 气相色谱-质谱测定绿茶提取液冠突散囊菌发酵前后挥发性香气成分
Table 1 GC-MS analysis of volatile flavor compounds of green tea infusion fermented with E. cristatum

序号 保留时间/min 化合物 峰面积（×10）审评样 浸提样 灭菌样 发酵样1 16.18 柠檬烯 limonene 0.468±0.022 0.133±0.017 — —2 16.41 2,2,6-三甲基环庚烷2,2,6-trimethylcyclohexanone 1.163±0.079 — — —3 16.83 苯乙醛 benzenacetaldehyde 0.170±0.028 — — —4 18.21 芳樟醇氧化物I linalool oxide I 0.515±0.023 — — 1.621±0.16 5 19.02 芳樟醇氧化物II linalool oxide II 0.114±0.027 — — 0.347±0.23 6 19.34 苯甲酸甲酯 methyl benzoate — — — 0.347±0.18 7 19.79 芳樟醇 linalool 3.283±0.198 0.181±0.022 0.420±0.114 7.546±0.06 8 20.01 壬醛 lonanal 4.161±0.106 0.163±0.033 0.061±0.026 0.456±0.07 9 20.23 苯乙醇 phenethyl alcohol 0.116±0.034 0.077±0.036 — —10 20.61 异佛尔酮 isophorone — — — 0.202±0.100 11 22.23 对甲氧基苯乙烯 4-methoxystyrene — — — 16.540±1.85 12 23.36 苯乙酸甲酯 methyl phenylacetate 0.121±0.015 — — 0.156±0.02 13 23.63 萘 naphthalene 0.840±0.092 — — —14 24.13 水杨酸甲酯 methyl salicylate 0.396±0.078 — — —15 24.35 α-松油醇 alpha-terpineol 0.379±0.066 0.029±0.011 0.041±0.013 1.586±0.200 16 24.45 藏花醛 safranal 0.773±0.145 0.053±0.013 0.073±0.013 0.172±0.06 17 24.72 十二烷 dodecane 0.147±0.024 — — 0.072±0.020 18 24.94 癸醛 decanal 0.630±0.024 0.137±0.085 — 0.156±0.02 19 25.17 对乙基苯甲醛 4-ethylbenzaldehyde — — — 0.834±0.150 20 25.38 β-环柠檬醛 β-cyclocitral 1.795±0.330 0.133±0.038 — 0.233±0.130 21 25.87 2-莰烯 2-bornene 0.054±0.012 — — —22 26.03 L-香芹醇 carveol 2.438±0.183 — — —23 26.97 香叶醇 geraniol — — — 0.501±0.16 24 27.06 橙花醇 nerol 1.868±0.378 0.175±0.018 — —25 27.34 己酸酐 hexanoic anhydride 0.195±0.033 — — —26 27.52 反-2-癸烯醛 3-heptylacrolein 0.349±0.045 — — 0.383±0.080 27 28.73 吲哚 indole 1.643±0.205 0.100±0.036 — —28 29.07 茶螺烷 2,6,10,10-tetramethyl-1-oxaspiro[4.5]dec-6-ene 0.175±0.034 — — —29 29.36 十三烷 n-tridecane 0.119±0.033 0.064±0.019 — 0.237±0.080 30 29.48 2-甲基萘 2-methylnaphthalene 0.178±0.039 — — 0.071±0.030 31 30.19 香叶酸甲酯 methyl geranate — — — 2.311±0.220 32 31.22 3,4-二甲基苯甲酸甲酯methyl 3,4-dimethylbenzoate — — — 5.019±0.320 33 31.47 1,1,6-trimethyl-1,2-dihydro naphthalene 0.139±0.007 — — —34 31.57 1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘1,1,6-trimethyltetralint 0.067±0.010 — — —35 32.09 4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛4-methyl-2-phenyl-2-pentenal — — — 0.609±0.180 36 32.63 β-大马士酮 beta-damascenone — — — 0.897±0.170 37 32.82 (Z)-己酸-3-己烯酯3-hexenyl ester, (Z)-hexanoic acid 0.391±0.018 — — 0.063±0.030 38 33.24 顺-茉莉酮 jasmone 0.454±0.084 0.058±0.022 — 0.166±0.050 39 33.77 十四烷 tetradecane 0.359±0.112 — — 0.095±0.020 9

续表1

注：—.未检出。表3同。

序号 保留时间/min 化合物 峰面积（×109）审评样 浸提样 灭菌样 发酵样40 33.87 月桂醛 dodecyl aldehyde 0.063±0.041 — — —41 34.50 α-紫罗酮 α-ionone 0.069±0.026 — — 0.211±0.100 42 35.15 2,2,4-三甲基-1,2-二氢呋喃1,2-dihydro-2,2,4-trimethylquinoline — — — 0.279±0.050 43 35.63 香叶基丙酮6,10-dimethylundeca-5,9-dien-2-one0.518±0.078 0.107±0.028 — —44 36.07 2,6-二叔丁基苯醌2,6-di-tert-butyl-p-benzoquinone 0.410±0.157 0.097±0.035 0.059±0.026 0.266±0.090 45 36.82 β-紫罗酮 β-ionone 0.431±0.190 0.640±0.087 0.200±0.104 0.312±0.080 46 37.47 十五烷 n-pentadecane 0.163±0.025 0.129±0.020 0.059±0.016 0.061±0.020 47 38.07 2,5-二叔丁基酚2,5-di-tert-butylphenol 0.113±0.011 0.074±0.031 0.024±0.008 1.339±0.090 48 41.23 季酮酸 tetronic acid 0.380±0.105 — — 0.867±0.170 49 41.86 十六烷 n-hexadecane 0.198±0.013 0.191±0.057 0.088±0.006 0.067±0.020 50 42.27 肉豆蔻醛 tetradecanal 0.372±0.040 — — —51 45.42 2-十四酮 2-tetradecanone 0.752±0.063 0.126±0.069 — —52 45.73 十七烷 n-heptadecane 0.240±0.036 0.095±0.026 — —53 49.38 植烷 phytane 0.257±0.030 — — —54 49.94 肉豆蔻酸异丙酯 isopropyl myristate 0.667±0.104 0.072±0.019 — —55 50.03 咖啡碱 caffeine 0.698±0.054 0.107±0.026 — 1.141±0.230 56 50.48 植酮 fi tone 2.119±0.331 0.057±0.021 — 0.196±0.080 57 50.92 邻苯二甲酸二异丁酯diisobutyl phthalate 2.865±0.427 0.126±0.058 0.063±0.015 0.919±0.220 58 53.30 棕榈酸甲酯 methyl hexadecanoate 0.926±0.284 — — —59 53.74 棕榈油酸 almititoleic acid 2.511±0.390 — — —60 54.05 邻苯二甲酸二丁酯 dibutyl phthalate 1.103±0.222 0.360±0.105 0.020±0.008 0.311±0.070 61 54.47 棕榈酸 palmitic acid 0.754±0.067 — — —62 55.76 十八烷 octadecane 0.801±0.272 — — —63 58.69 呋喃它酮 furaltadone 0.530±0.129 — — —64 59.86 反-13-十八碳烯酸trans-13-octadecenoic acid 0.926±0.001 — — —65 60.74 硬脂酸 stearic acid 2.841±0.187 — — —66 64.57 油酸酰胺 oleamide 0.468±0.196 0.064±0.007 — 0.054±0.020 67 65.05 己二酸二(2-乙基己)酯bis(2-ethylhexyl) adipate 0.242±0.025 — — —68 67.39 邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯bis(2-ethylhexyl) phthalate 0.400±0.064 — — —总量 45.045 3.544 1.107 46.643

表2 绿茶提取液冠突散囊菌发酵过程中不同类型香气总量变化
Table 2 Changes in concentrations of different chemical groups of aroma components during fermentation of green tea infusion with E. cristatum

香气类别 峰面积（×109）审评样 浸提样 灭菌样 发酵样醇类 8.713 0.462 0.461 11.601醛类 8.312 0.485 0.134 2.843酮类 4.873 0.987 0.200 1.984酸类 7.142 0.000 0.000 0.867酯类 7.111 0.558 0.083 9.126碳氢化合物 4.143 0.611 0.147 17.072其他 4.751 0.443 0.083 3.150总量 45.045 3.544 1.107 46.643

2.2 红茶提取液冠突散囊菌发酵前后挥发性组分特征

从红茶原料中共检测出49 种化合物（表3），其中含量较高的10 种成分分别为橙花醇、β-紫罗酮、芳樟醇、苯乙醇、壬醛、苯乙醛、β-环柠檬醛、芳樟醇氧化物II、水杨酸甲酯、苯乙酸甲酯、邻苯二甲酸二异丁酯。通过对香气类型进行分析（表4），醇类6 种、醛类13 种、酮类5 种、酸类1 种、酯类8 种、碳氢化合物10 种、其他6 种。含量最高醇类，占香气总量的31.0%，其次是醛类、酮类、酯类、碳氢化合物、酸类，各占28.0%、14.7%、11.6%、9.0%和3.1%。这些挥发性成分构成了红茶原料的香气特征。

表3 气相色谱-质谱测定红茶提取液冠突散囊菌发酵前后挥发性香气成分
Table 3 GC-MS analysis results of volatile flavor compounds of black tea infusion fermented with E. cristatum

序号 保留时间/min 化合物 峰面积（×109）审评样 浸提样 灭菌样 发酵样1 16.41 2,2,6-三甲基环庚烷2,2,6-trimethylcyclohexanone 0.298±0.048 0.101±0.019 — —2 16.83 苯乙醛 benzenacetaldehyde 2.358±0.227 1.593±0.204 1.758±0.170 0.570±0.202 3 18.20 芳樟醇氧化物I linalool oxide I 0.831±0.124 0.401±0.137 0.426±0.174 0.136±0.048 4 19.02 芳樟醇氧化物II linalool oxide II 1.629±0.081 1.018±0.044 0.878±0.122 0.267±0.105 5 19.34 苯甲酸甲酯 methyl benzoate — — — 1.146±0.149 6 19.79 芳樟醇 linalool 3.296±0.130 1.677±0.118 2.020±0.251 0.806±0.157 7 20.01 壬醛 nonanal 2.424±0.248 1.402±0.242 1.134±0.305 0.144±0.017 8 20.23 苯乙醇 phenethyl alcohol 3.031±0.277 — — —9 20.61 异佛尔酮 isophorone — — — 0.211±0.069 10 22.23 对甲氧基苯乙烯 4-methoxystyrene — — — 0.083±0.014 11 22.67 反-2-壬烯醛 (E)-non-2-enal 0.550±0.175 0.073±0.021 0.200±0.055 —12 23.36 苯乙酸甲酯 methyl phenylacetate 1.399±0.132 0.921±0.349 0.562±0.141 0.176±0.014 13 24.13 水杨酸甲酯 methyl salicylate 0.724±0.054 0.486±0.212 0.266±0.141 —14 24.35 α-松油醇 p-menth-1-en-8-ol 0.370±0.096 0.190±0.091 0.410±0.162 0.062±0.029 15 24.45 藏花醛 safranal 0.852±0.181 0.513±0.108 0.555±0.053 0.061±0.016 16 24.72 十二烷 dodecane 0.375±0.133 0.311±0.113 0.507±0.104 0.090±0.019 17 24.94 癸醛 decanal 0.639±0.170 0.448±0.201 0.225±0.081 0.175±0.038 18 25.17 对乙基苯甲醛 4-ethylbenzaldehyde — — — 0.076±0.019 19 25.38 β-环柠檬醛 β-cyclocitral 1.877±0.293 0.886±0.058 0.804±0.068 0.040±0.019 20 25.87 2-莰烯 2-bornene 0.560±0.167 0.690±0.095 2.908±0.140 0.398±0.029 21 26.97 香叶醇 geraniol — — 2.389±0.159 1.310±0.065 22 27.06 橙花醇 nerol 5.120±0.198 4.610±0.179 — —23 27.52 反-2-癸烯醛 3-heptylacrolein 0.416±0.197 0.245±0.023 0.185±0.015 —24 27.67 2-苯基巴豆醛 2-phenylcrotonaldehyde 0.570±0.144 0.526±0.004 0.452±0.123 —25 27.75 柠檬醛 citral 0.863±0.034 0.467±0.021 0.180±0.051 —26 28.56 茴香脑 anethole 0.315±0.027 0.167±0.023 0.108±0.050 —27 28.81 1-亚乙基-1H-茚 1-ethylidene-1H-indene — — 0.419±0.188 —28 29.07 茶螺烷 2,6,10,10-tetramethyl-1-oxaspiro[4.5]dec-6-ene 0.329±0.072 0.116±0.017 0.083±0.023 —29 29.36 十三烷 n-tridecane 0.529±0.228 0.569±0.069 0.633±0.150 0.202±0.012 30 30.19 香叶酸甲酯 methyl geranate — — — 0.178±0.031 31 31.22 3,4-二甲基苯甲酸甲酯methyl 3,4-dimethylbenzoate — — — 0.606±0.143 32 31.47 1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘1,1,6-trimethyl-1,2-dihydro naphthalene0.321±0.070 0.100±0.032 0.147±0.041 —33 31.57 1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘1,1,6-trimethyltetralint 0.138±0.035 0.051±0.014 0.062±0.031 —34 32.09 4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛4-methyl-2-phenyl-2-pentenal 0.754±0.227 0.432±0.154 0.241±0.112 —35 32.63 β-大马士酮 beta-damascenone 0.792±0.131 0.754±0.092 2.805±0.154 0.305±0.101 36 32.82 (Z)-己酸-3-己烯酯3-hexenyl ester, (Z)-hexanoic acid 0.373±0.161 0.082±0.018 0.057±0.022 —

续表3

序号 保留时间/min 化合物 峰面积（×109）审评样 浸提样 灭菌样 发酵样37 33.77 十四烷 tetradecane 0.593±0.129 0.109±0.023 0.135±0.022 0.068±0.017 38 33.87 月桂醛 dodecyl aldehyde 0.836±0.183 0.331±0.032 0.223±0.088 —39 34.50 α-紫罗酮 α-ionone 0.813±0.105 0.372±0.051 0.225±0.098 0.047±0.011 40 35.15 2,2,4-三甲基-1,2-二氢呋喃1,2-dihydro-2,2,4-trimethylquinoline — — 0.184±0.037 —41 35.63 香叶基丙酮6,10-dimethylundeca-5,9-dien-2-one 0.733±0.154 0.322±0.113 0.213±0.089 —42 36.07 2,6-二叔丁基苯醌2,6-di-tert-butyl-p-benzoquinone 0.193±0.069 0.315±0.073 0.641±0.090 0.026±0.006 43 36.82 β-紫罗酮 β-ionone 4.204±0.424 2.550±0.149 1.534±0.261 0.195±0.019 44 37.03 可卡醛 5-methyl-2-phenyl-2-hexenal0.578±0.187 0.382±0.081 0.280±0.071 0.088±0.021 45 37.85 十五烷 n-pentadecane 0.245±0.083 0.185±0.017 0.194±0.044 —46 38.07 2,5-二叔丁基酚2,5-di-tert-butylphenol 0.317±0.044 0.242±0.064 0.945±0.296 0.286±0.037 47 40.52 顺式-3-己烯醇苯甲酸酯cis-3-hexenyl benzoate 0.755±0.192 0.416±0.136 0.217±0.103 —48 41.23 季酮酸 tetronic acid 1.185±0.021 0.285±0.024 1.653±0.181 0.474±0.043 49 41.86 十六烷 n-hexadecane 0.896±0.129 0.172±0.018 0.119±0.016 0.029±0.012 50 42.27 肉豆蔻醛 tetradecanal 0.180±0.057 0.070±0.021 0.097±0.016 —51 45.73 十七烷 n-heptadecane 0.192±0.038 — — —52 49.38 植烷 phytane 0.110±0.012 — — —53 49.94 肉豆蔻酸异丙酯 isopropyl myristate0.086±0.034 — — —54 50.03 咖啡碱 caffeine 0.154±0.027 0.144±0.065 0.384±0.130 0.102±0.008 55 50.48 植酮 fi tone 0.221±0.076 0.067±0.011 0.156±0.061 0.054±0.016 56 50.92 邻苯二甲酸二异丁酯diisobutyl phthalate 1.305±0.203 0.263±0.011 1.021±0.026 0.553±0.149 57 53.30 棕榈酸甲酯 methyl hexadecanoate 0.324±0.059 — — —58 54.05 邻苯二甲酸二丁酯 dibutyl phthalate0.373±0.149 0.093±0.021 0.254±0.083 0.175±0.029总量 46.020 25.144 28.889 9.137

由表3可以看出，浸提和灭菌对红茶茶香气物质种类的影响不大。香气物质种类无显著变化，浸提后仍有44 种，而灭菌后的红茶浸提液检测出45 种挥发性物质。浸提后能检测到的香气物质含量不同程度的下降，变化的最大是酸类和酯类，比起原料，酸类减少了75.9%，酯类减少了57.7%。

经过冠突散囊菌发酵后的红茶浸提液中共检测到35 种化合物（表4），其中含量较高的10 种香气物质分别为苯甲酸甲酯、香叶醇、芳樟醇、3,4-二甲基苯甲酸甲酯、苯乙醛、邻苯二甲酸二异丁酯、季酮酸、2-莰烯、β-大马士酮、2,5-二叔丁基苯酚。发酵后，红茶发酵液中各香气物质含量呈现下降趋势，其中醛类的变化最大，比起原料减少了91.1%，部分醛类物质在发酵后未检出，包括反-2-壬烯醛、2-苯基巴豆醛、顺柠檬醛、4-甲基-2-苯基-2-戊烯醛、月桂醛、肉豆蔻醛；而苯乙醇、橙花醇、水杨酸甲酯、茴香脑、茶螺烷、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢-1,1,6-三甲基萘、(Z)-己酸-3-己烯酯、香叶基丙酮、十五烷、顺式-3-己烯醇、苯甲酸酯、十七烷、植烷、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸甲酯等物质在发酵后也未检出。同时发酵后的浸提液出现了6 种原料中没有的化合物，分别为苯甲酸甲酯、异佛尔酮、对甲氧基苯乙烯、对乙基苯甲醛、香叶酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯。

表4 红茶提取液冠突散囊菌发酵过程中不同类型香气总量变化
Table 4 Changes in concentrations of different chemical groups of aroma components during fermentation of black tea infusion with E. cristatum

香气类别 峰面积（×109）审评样 浸提样 灭菌样 发酵样醇类 14.277 7.896 6.123 2.582醛类 12.895 7.369 6.335 1.153酮类 6.761 4.065 4.933 0.812酸类 1.185 0.285 1.653 0.474酯类 5.339 2.260 2.377 2.833碳氢化合物 4.125 2.252 4.579 0.870其他 1.438 1.017 2.890 0.413总量 46.020 25.144 28.889 9.137

3 讨 论

在绿茶和红茶原料中，均检出苯乙醇、芳樟醇及其氧化物、水杨酸甲酯等特征香气成分，这与已有研究结果吻合[23-27]。但绿茶和红茶原料中的香气物质在组成和含量上有显著差别[28]。虽然绿茶原料中检出的化合物种类比红茶多，但大部分测得的香气物质含量在红茶中更高。

茶叶中绝大部分挥发性成分在浸提以及灭菌过程中挥发丢失或减少。浸提过程中水浴温度约为100 ℃，而灭菌锅工作的温度为121 ℃、压强为0.1 MPa。原料中测得的挥发性成分在常压下的沸点基本为190～210 ℃左右，因此在浸提以及灭菌的过程中丢失或减少。但也有极少数的挥发性物质经过浸提或者灭菌后含量增加，这可能与某些物质的氧化降解有关，比如有研究显示胡萝卜素热降解生成紫罗酮等物质。

苯甲酸甲酯、异佛尔酮、对甲氧基苯乙烯、对乙基苯甲醛、香叶酸甲酯、3,4-二甲基苯甲酸甲酯，这6 种物质是绿茶和红茶浸提液原料不存在而在发酵后新生成的共有化合物。其中苯甲酸甲酯，又名安息香酸甲酯，具有浓郁的冬青油和尤南迦油香气。异佛尔酮带有薄荷香或樟脑味。这些新生成的香气物质赋予发酵后的茶汤新的香气特征。

绿茶汤经冠突散囊菌发酵后，芳樟醇为原料的2.30 倍，芳樟醇氧化物I为3.15 倍，芳樟醇氧化物II为3.04 倍，苯乙酸甲酯为1.29 倍，α-松油醇为4.18 倍，反-2-癸烯醛为1.10 倍，α-紫罗酮为3.08 倍。但红茶汤经冠突散囊菌发酵后香气物质含量比起原料基本是降低的，因此冠突散囊菌发酵红茶带来香气种类与含量的下降，并没有改善效果，其原因可能是冠突散囊菌发酵形成香气的底物在红茶加工过程中已经发生了较大的消耗，而发酵又让原本形成的很多香气成分损失。因此，利用冠突散囊菌发酵来开发深加工茶产品应以低档绿茶为原料为主，这将更有利于改善产品香气组成，形成“菌花香”。

王华夫等[29]研究了传统茯砖茶香气成分的变化，发现醛类香气物质含量呈现上升的趋势，但在本实验中则出现下降的趋势。这种可能由于发酵工艺、萃取方式以及所用茶样不同导致。何红霞等[30]运用同时蒸馏萃取-气相色谱-质谱联用法测定茯茶“散茶发花”过程中香气成分，发现变化最为显著的1-辛烯-3-醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物I和II对形成散茯茶的特征香气有重要贡献。本实验中未测得1-辛烯-3-醇，但芳樟醇、芳樟醇氧化物I和II的变化趋势相同。

参考文献：

[1] 孙其富, 梁月荣. 茶饮料香气研究进展和增香技术探讨[J]. 茶叶,2003, 29(4): 191-184. DOI:10.3969/j.issn.0577-8921.2003.04.007.

[2] 李艳青, 付大友, 王蓉. 茶叶香气成分测定方法研究进展[J]. 茶叶科学技术, 2009(1): 9-11. DOI:10.3969/j.issn.1007-4872.2009.01.003.

[3] ZHENG X Q, LI Q, XIANG L, et al. Recent advances in volatiles of teas[J]. Molecules, 2016, 21(3): 338. DOI:10.3390/molecules21030338.

[4] HAN Z X, RANA M M, LIU G F, et al. Green tea flavour determinants and their changes over manufacturing processes[J]. Food Chemistry,2016, 212: 739-748. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.06.049.

[5] 齐祖同, 孙曾美. 茯砖茶中优势菌群的鉴定[J]. 真菌学报, 1990,9(3): 176-179. DOI:10.13346/j.mycosystema.1990.03.002.

[6] MAO Y, WEI B Y, TENG L W, et al. Analyses of fungal community by Illumina MiSeq platforms and characterization of Eurotium,species on Liupao tea, a distinctive post-fermented tea from China[J].Food Research International, 2017, 99: 641-649. DOI:10.1016/j.foodres.2017.06.032.

[7] 傅冬和, 刘仲华, 黄建安, 等. 茯砖茶加工过程中主要化学成分的变化[J]. 食品科学, 2008, 29(2): 64-67. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.02.007.

[8] 李佳莲, 胡博涵, 刘素纯, 等. 微生物与茯砖茶品质形成研究进展[J]. 食品工业科技, 2010, 31(9): 406-408. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2010.09.022.

[9] LI Q, HUANG J N, LI Y D, et al. Fungal community succession and major components change during manufacturing process of Fu brick tea[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 6947. DOI:10.1038/s41598-017-07098-8.

[10] 王增盛, 施兆鹏, 刘仲华, 等. 论黑茶品质及风味形成机理[J]. 茶叶科学, 1991(增刊1): 1-9. DOI:10.13305/j.cnki.jts.1991.s1.001.

[11] 田鸿, 齐桂年, 尹旭敏. 冠突散囊菌发酵型茶饮料的研究[J]. 食品与发酵工业, 2008, 34(1): 164-167. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2008.01.034.

[12] 徐瑞瑞, 李立祥, 倪媛, 等. 绿茶液冠突散囊菌发酵期间品质变化的研究[J]. 安徽农业大学学报, 2010(3): 478-482. DOI:10.13610/j.cnki.1672-352x.2010.03.013.

[13] 黄秋桂, 张灵枝, 龚雪梅, 等. 黑茶优势菌对绿茶提取液发酵过程多酚类化合物的影响[J]. 食品科学, 2014, 35(11): 164-167.DOI:10.16429/j.1009-7848.2013.01.030.

[14] 黄群, 李彦坡, 陈林杰, 等. 冠突散囊菌液态发酵过程中黑茶活性成分变化研究[J]. 食品科学, 2007, 28(12): 231-234. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2007.12.053.

[15] 颜鸿飞, 王美玲, 白秀芝, 等. 湖南茯砖茶香气成分的SPME-GCTOF-MS分析[J]. 食品科学, 2014, 35(22): 176-180. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201422033.

[16] 赵仁亮, 吴丹, 姜依何, 等. 不同产地黑毛茶加工的茯砖茶香气成分和品质分析[J]. 湖南农业大学学报, 2017, 43(5): 551-555.DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2017.05.015.

[17] 刘巧林, 齐桂年. 微生物在发酵茶饮料中的应用[J]. 福建茶叶,2007(1): 23-24. DOI:10.3969/j.issn.1005-2291.2007.01.012.

[18] 袁思思, 柏珍, 黄亚辉, 等. 3 种黑茶的香气分析[J]. 食品科学, 2014,35(2): 252-256. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201402049.

[19] 胡均鹏, 贾盟盟, 朱良. 不同提取方法对安化茯砖茶挥发油成分的影响[J]. 食品科技, 2018, 43(5): 270-274. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2018.05.049

[20] YANG T, ZHU Y, SHAO C, et al. Enantiomeric analysis of linalool in teas using headspace solid-phase microextraction with chiral gas chromatography[J]. Industrial Crops and Products, 2016, 83: 17-23.DOI:10.1016/j.indcrop.2015.12.025.

[21] YANG W, YU J, PEI F, et al. Effect of hot air drying on volatile compounds of Flammulina velutipes detected by HS-SPME-GCMS and electronic nose[J]. Food Chemistry, 2016, 196: 860-866.DOI:10.1016/j.foodchem.2015.09.097.

[22] ARHTUR C, PAWLISZYN J. Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fiberes[J]. Analytical Chemistry, 1990, 62: 2145-2150. DOI:10.1021/ac00218a019.

[23] 王秋霜, 陈栋, 许勇泉, 等. 广东红茶香气成分的比较研究[J]. 茶叶科学, 2012(1): 9-16. DOI:10.3969/j.issn.1000-369X.2012.01.002.

[24] 王秋霜, 陈栋, 许勇泉, 等. 中国名优红茶香气成分的比较研究[J].中国食品学报, 2013, 13(1): 195-200. DOI:10.16429/j.1009-7848.2013.01.030.

[25] 叶国注, 江用文, 尹军峰, 等. 绿茶香气HS-SPME提取方法研究[J]. 中国茶叶, 2009(10): 16-19. DOI:10.3969/j.issn.1000-3150.2009.10.008.

[26] YANG Y Q, YIN H X, YUAN H B, et al. Characterization of the volatile components in green tea by IRAE-HS-SPME/GC-MS combined with multivariate analysis[J]. PLoS ONE, 2018, 13(3):e0193393. DOI:10.1371/journal.pone.0193393.

[27] MAO S H, LU C Q, LI M F, et al. Identification of key aromatic compounds in Congou black tea by PLSR with variable importance of projection scores and gas chromatography-mass spectrometry/gas chromatography-olfactometry[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2018, 98(14): 5278-5286. DOI:10.1002/jsfa.9066.

[28] P O N M U R U G A N P, M A N J U K A R U N A M B I K A K,GNANAMANGAI B M. Impact of various foliar diseases on the biochemical, volatile and quality constituents of green and black teas[J]. Australasian Plant Pathology, 2016, 45(2): 175-185.DOI:10.1007/s13313-016-0402-y.

[29] 王华夫, 李名君, 刘仲华, 等. 茯砖茶在发花过程中的香气变化[J].茶叶科学, 1991(增刊1): 81-86. DOI:10.13305/j.cnki.jts.1991.s1.014.

[30] 何红霞, 金莉莎. 茯茶“散茶发花”过程香气成分的变化[J]. 茶叶通讯, 2012(1): 15-19. DOI:10.3969/j.issn.1009-525X.2012.01.003.

Effect of Fermentation with Eurotium cristatum on Aroma Components of Tea Infusions

ZHENG Mengxia, LI Huijuan, CHEN Shuna, ZHAO Zhen, LIU Xinqiu, LI Xinghui, CHEN Xuan*
(Institute of Tea Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract: The aroma components of green tea and black tea infusions were quantified by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS) before and after fermentation with Eurotium cristatum. It was found that benzoic acid methyl ester, isophorone, methoxy styrene, ethyl benzene, formaldehyde,sweet folic acid methyl ester, and 3,4-dimethyl methyl benzoic acid were detected in the fermented tea infusions, but not in the fresh ones. In the green tea infusion, the concentrations of linalool, linalool oxide I, linalool oxide II, methyl phenylacetate, α-terpineol, trans-2-decylolefine aldehyde, and α-ionone were elevated by 2.30, 3.15, 3.04, 1.29, 4.18, 1.10 and 3.08, respectively after the fermentation, and the number and amount of aroma components increased similarly. In contrast, for the black tea infusion, the majority of the aroma compounds decreased and phenethyl alcohol, trans-2-nonenal,2-phenylcrotonaldehyde, cis-citral, 4-methyl-2-phenyl-2-pentenal, lauraldehyde and tetradecanal were undetectable after the fermentation, indicating a loss of the total amount of aroma components. Compared to black tea, low-end green tea was more suitable for the processing of fermented beverage with E. cristatum.

Keywords: Eurotium cristatum； low-grade tea； liquid-state fermentation； aroma compounds； gas chromatography-mass spectrometry

收稿日期：2018-10-22

基金项目：现代农业产业技术体系建设专项（CARS-23）；江苏现代农业产业技术体系建设项目（JATS[2018]212）；江苏省大学生创业实践计划项目（201810307005P）

第一作者简介：郑梦霞（1990—）（ORCID: 0000-0002-5224-1581），女，硕士研究生，研究方向为茶叶生物化学与综合利用。E-mail: zhengmengxia@tricaas.com

*通信作者简介：陈暄（1973—）（ORCID: 0000-0001-5553-3638），男，副教授，博士，研究方向为茶叶生物化学。E-mail: chenxuan@njau.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181022-230

中图分类号：TS272

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2019）18-0223-06

引文格式：郑梦霞, 李会娟, 陈淑娜, 等. 冠突散囊菌发酵对茶汤香气成分的影响[J]. 食品科学, 2019, 40(18): 223-228. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181022-230. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Mengxia, LI Huijuan, CHEN Shuna, et al. Effect of fermentation with Eurotium cristatum on aroma components of tea infusions[J]. Food Science, 2019, 40(18): 223-228. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181022-230. http://www.spkx.net.cn