低温等离子体是在高电压情况下处于高度电离状态的混合物，主要由气体放电产生，常见的有电晕放电、介质阻挡放电（dielectric barrier discharges，DBD）、沿面放电及铁电放电等[1]。其中，DBD作为一种安全、有效的灭菌方法，在净化污染、生物医药、食品和包装材料处理等方面取得了广泛的应用[2]。DBD低温等离子体发生装置操作简单[3]，对病毒、细菌等均有较高的清除率[4]，处理过程中不会使样品产生明显升温[5]，而且在一定程度上避免了传统先杀菌后包装造成的二次污染[6]，具有广泛应用于食品工业生产的前景。
肉和肉制品作为我国食品行业中的第一大产业，有效的杀菌保鲜方式对提高其流通贮藏品质有重要的意义，采用低温等离子体杀菌技术抑制肉制品中的微生物成为国内外学者研究的热点之一[7-8]。Alonso等[9]研究发现，DBD是产生高浓度O3的一种十分有效的技术手段，采用DBD低温等离子体可以使O3含量从20 g/nm3提高到200 g/nm3，具有良好的杀菌效果。Wang Jiamei等[10]采用DBD低温等离子体处理气调包装的鸡胸肉，贮藏7 d微生物总数相对空气包装可降低2（lg（CFU/g）），且对其感官影响不大。Kim等[11]发现DBD低温等离子体处理能够明显降低猪排中大肠杆菌及李斯特菌含量，但是会降低样品pH值及亮度，氧气与氦气混合激发形成的低温等离子体会显著提高样品的硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量。
然而，高压电场低温等离子体在处理过程中由于体系中高能粒子和自由电子相互碰撞等因素，会产生大量具有反应活性的诸如•OH、O2－•、H2O2、O3等自由基及活性成分[12]，该类自由基活性很高，会导致脂质中产生催化其自动氧化的引发剂ü ü过氧自由基和烷氧自由基等[13]，Vandamme等[14]研究发现非热低温等离子体产生的氧化物能加速油酸的氧化进程。因此，低温等离子体处理食品在达到杀菌效果的同时，也存在加速高油脂食品脂质氧化的风险。
DBD低温等离子体处理对肉制品中脂质氧化的影响鲜有报道，对于肉制品中脂质氧化的影响尚不明确，而且其对肌肉脂质氧化的影响也不容忽视。因此，在本课题组对DBD低温等离子体抑制微生物生长研究的基础上[15-16]，本研究分析不同处理条件对生鲜猪肉脂质一次氧化及二次氧化的影响，并通过脂质氧化动力学分析低温等离子体对脂质氧化影响的机理，探索该技术在生鲜肉保鲜加工方面的应用可行性，以期通过调控脂质氧化为低温等离子体新型技术在食品工业领域中的应用提供理论依据。
猪背最长肌 南京苏果超市；聚对苯二甲酸乙二醇酯/聚乙烯（polyethylene terephthalate/polyethylene，PET/PE）热成型盒构成的双层复合包装材料 苏州森瑞保鲜设备有限公司；石油醚、异辛烷、冰乙酸、碘化钾、硫代硫酸钠、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、TBARS、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二钠、三氯甲烷等均为国产分析纯。
MAP-H360复合气调保鲜包装机 苏州森瑞保鲜设备有限公司；低温等离子体冷杀菌设备 美国凤凰科技公司；JA2203N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；BSC-250型恒温恒湿箱 上海博迅实业有限公司；RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器有限公司；HH-S系列数显恒温水浴锅 常州万达升实验仪器有限公司；Allegra 64R型高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；UV-2600型紫外-可见分光光度计日本岛津公司。
1.3.1 生鲜猪肉脂质提取及处理
将原料肉剔除筋、膜及其他杂质，称取用绞肉机绞碎的猪背最长肌100 g于500 mL具塞三角瓶中，加150 mL石油醚（沸程30～60 ℃）振荡10 min后放置过夜，减压抽滤，取滤液于35 ℃下旋转蒸发，回收溶剂得到油脂。重复此过程，得到足量的生鲜猪肉脂质，－40 ℃冰箱保存备用。
取10 g上述脂质放置于经紫外灯照射30 min的PE热成型盒（17 cmh12 cmh3.2 cm）中，充空气包装，从中随机抽取4 盒作为对照组，其余分别按不同处理条件进行低温等离子体处理，并按照不同实验温度贮存待测。
1.3.2 脂质氧化指标测定
1.3.2.1 POV测定
过氧化值（peroxide value，POV）的测定参照LS/T 6106ü2012《动植物油脂 过氧化值测定 自动滴定分析仪法》[17]略作修改。称取1 g左右脂肪，置于250 mL碘量瓶中，加入异辛烷、冰乙酸（体积比2∶3）混合溶液25 mL，加塞摇动使其溶解。准确加入0.5 mL饱和碘化钾溶液，盖上塞子使其反应（60f1）s，在此期间摇动至少3 次，然后立即加入30 mL蒸馏水。用0.01 mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定，直到黄色几乎消失时加入0.5 mL淀粉指示剂，继续滴定并强烈振摇至蓝色消失。
1.3.2.2 TBARS含量测定
参照GB 5009.181ü2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》略作修改[18]。准确称取在70 ℃水浴融化均匀的猪油2 g，置于100 mL有盖三角瓶内，加入10 mL三氯乙酸混合液（质量分数0.1%乙二胺四乙酸二钠及质量分数7.5%三氯乙酸），50 ℃振摇0.5 h，用双层滤纸过滤两次。准确移取上述滤液5 mL置于25 mL纳氏比色管内，加入5 mL硫代巴比妥酸溶液（0.02 mol/L），混匀，加塞，置于90 ℃水浴保温40 min，取出冷却1 h，移入小试管2 000 r/min离心5 min，吸出上清液于532 nm波长处比色。同时做不添加猪油的空白实验，TBARS含量通过标准曲线计算，结果表示为试样中丙二醛含量。
1.3.3 低温等离子体处理条件对生鲜猪肉脂质氧化的影响
在本课题组对DBD低温等离子体杀菌研究的基础上探讨其对生鲜猪肉脂质氧化的影响，固定DBD低温等离子体发生系统上、下电极板高度间隔为3.5 cm。通过预实验确定低温等离子体处理条件，筛选出稳定放电产生低温等离子体、杀菌效果好且对样品形态特征无影响的处理电压和时间范围，同时参照乔维维等[16]的处理条件，固定电压70 kV、时间60 s分别进行单因素试验，经低温等离子体处理后放置24 h，待杀菌效果发挥后[19]取样检测各项指标。
1.3.3.1 低温等离子体处理时间对脂质氧化的影响
将1.3.1节空气包装后的猪肉脂质于70 kV电压强度条件下，按照时间0、20、40、60、80 s处理后，分别于4、10、20、30、40、50 ℃条件下贮藏24 h，不同处理组随机抽取3 个重复样测定其POV及TBARS含量。以未处理样品在相同包装条件下静置24 h作为对照组。
1.3.3.2 低温等离子体处理电压对脂质氧化的影响
将1.3.1节空气包装后的猪肉脂质于60 s处理时间条件下，按照电压30、40、50、60、70、80 kV处理后，分别于4、10、20、30、40、50 ℃条件下贮藏24 h，不同处理组随机抽取3 个重复样测定其POV及TBARS含量。以未处理样品在相同包装条件下静置24 h作为对照组。
1.3.4 脂质氧化动力学分析
根据Calligaris等[20]的研究方法，通过对不同低温等离子体处理条件下POV与TBARS含量的测定结果进行线性回归分析来计算氢过氧化物和丙二醛生成的表观零级速率常数。然后利用阿伦尼乌斯方程（下式），通过ln k对1/T作图，计算各级氧化反应的活化能（activation energy，Ea）变化，评价低温等离子体处理时间、电压及贮藏温度对肌肉中脂质各级氧化速率的影响。
式中：k为化学反应速率常数；R为气体摩尔常数（8.314 J/（molg K））；T为绝对温度/K；Ea为反应活化能/（J/mol）；k0为指前因子或表观频率因子。
所有数据利用Excel软件进行处理，表示为fs。利用方差分析法对实验中所得的数据进行分析，研究低温等离子体不同处理时间或电压强度对脂质氧化影响的显著性，同一实验中不同处理平均值之间的差异采用Fisher’s LSD法进行检测，P＜0.05表示差异显著。
2.1.1 处理时间及贮藏温度对POV的影响
图1 处理时间及贮藏温度对POV的影响
Fig.1 Effect of processing time and storage temperature on POV
由图1中可以看出，在恒定电压强度下，随着处理时间的延长，肌肉脂质一次氧化程度不断增加，表现为POV呈显著的增加趋势；在处理0～80 s过程中，随着贮藏温度的升高，脂质中POV也显著增加；在高强度电压处理条件下，仅有4 ℃贮藏及40 ℃以下短时间贮藏处理组的POV符合食品安全国家标准（10 mmol/kg）[21]。因此可以看出，高压电场低温等离子体处理时间的延长及温度的升高均可促进肌肉中脂质一次氧化的程度，该项技术适用于低温贮藏短时处理猪肉产品。
2.1.2 电压强度及贮藏温度对POV的影响
图2 电压强度及贮藏温度对POV的影响
Fig.2 Effect of voltage and storage temperature on POV
由图2可以看出，随着低温等离子体处理电压强度的增加，不同贮藏温度下脂质POV呈显著增加趋势。另外，当电压强度为50～80 kV时，肌肉脂质中POV增加程度明显提高，并且在该电压强度范围内，随着贮藏温度的升高，POV显著增加（P＜0.05）。因此可以看出，电压强度的增加及贮藏温度的升高均会导致肌肉脂质中一次氧化产生的氢过氧化物的累积。
分析图1、2数据可知，在低温等离子体处理0～80 s和30～80 kV时，可通过计算分别得到不同贮藏温度下处理1 s或1 kV所积累的POV。以贮藏温度为横坐标，相应温度下处理1 s或1 kV所积累的POV为纵坐标分别作图，可得到线性关系：y1＝0.091 9x＋0.180 4（R2＝0.934 8）；y2＝0.163 7x＋0.255 9（R2＝0.980 5）。y1中斜率k1表示每增加1 ℃处理时间1 s所积累的POV；y2中斜率k2表示每增加1 ℃处理电压1 kV所积累的POV。在该范围内y2＞y1且k2＞k1，因此电压强度对脂质一次氧化的影响大于处理时间，可以为调控低温等离子体处理条件对脂质一次氧化的影响提供理论指导。
肌肉脂质中，通常用POV表示其一次氧化的程度。虽然POV只是氧化初期的一个近似指标，且过氧化物没有味道，不直接影响产品的风味，但它们却是重要的风味前体物质，很容易被进一步氧化生成醛、酮、酸和羟基酸等化合物[22]。通过测定POV只能用来评价脂质氧化初期的氧化程度，而不能用来评价整个连续氧化过程。从表观上分析低温等离子体处理时间、电压强度及贮藏温度对脂质一次氧化影响的结果可以看出，低温等离子体处理时间的延长、电压强度增加及贮藏温度的升高，均可造成肌肉脂质中过氧化物的累积，从而增加脂质一次氧化程度。
2.1.3 低温等离子体处理条件对脂质一次氧化Ea的影响
2.1.3.1 处理时间对脂质一次氧化Ea的影响
针对图1中数据，根据阿伦尼乌斯方程通过ln k对1/T作图，以1/T为横坐标，ln k为纵坐标，可得到不同处理时间条件下一次氧化k与T之间的关系如下：处理时间为20 s时，y＝－3 328.6x＋13.213（R2＝0.977 8）；处理时间为40 s时，y＝－3 772.7x＋15.509（R2＝0.943 4）；处理时间为60 s时，y＝－3 488.2x＋14.857（R2＝0.977 3）；处理时间为80 s时，y＝－2 917.7x＋13.18（R2＝0.961 1）。
在不同处理时间条件下，ln k与1/T呈明显的直线关系，并且R2均大于0.900 0。因此，通过不同直线的斜率即可确定不同处理时间条件下肌肉中脂肪氧化生成氢过氧化物反应所需的Ea。通过计算不同处理时间下脂质一次氧化反应的Ea来评价处理时间对肌肉中脂质一次氧化速率的影响。随着低温等离子体处理时间的延长，其脂质一次氧化所需的Ea呈现开口向下的二次抛物线形变化趋势，抛物线函数为y＝－0.005 3x2＋0.464 1x＋20.684（R2＝0.974 4）。计算抛物线函数最高点，可以发现当处理时间为43.8 s时，肌肉中脂质一次氧化所需的Ea最高，为30.84 kJ/mol。在低温等离子体处理时间为0～80 s时，脂质一次氧化所需Ea的范围为24.26～37.21 kJ/mol。
许多关于食用油脂氧化动力学的研究结果表明各种不同食用油脂氧化所需的Ea基本都在24～240 kJ/mol的范围内[23-24]。靳国锋[25]测得风干猪肉脂肪氧化生成氢过氧化物反应所需Ea为92.35 kJ/mol，表明运用低温等离子体设备处理猪肉肌肉脂质，脂质更容易发生一次氧化。
2.1.3.2 电压强度对脂质一次氧化Ea的影响
分析图2中数据，代入阿伦尼乌斯方程，以1/T为横坐标，ln k为纵坐标作图拟合分析，可得到不同处理电压条件下一次氧化k与T之间关系如下：处理电压为30 kV时，y＝－3 718.2x＋14.143（R2＝0.978 9）；处理电压为40 kV时，y＝－3 459.8x＋13.579（R2＝0.984 8）；处理电压为50 kV时，y＝－3 267.6x＋13.333（R2＝0.971 2）；处理电压为60 kV时，y＝－2 993.5x＋12.912（R2＝0.957 4）；处理电压为70 kV时，y＝－2 797.9x＋12.661（R2＝0.979 6）；处理电压为80 kV时，y＝－2 725.5x＋12.721（R2＝0.970 6）。
ln k与1/T呈明显的直线关系，并且R2均大于0.900 0。当电压强度在30～80 kV时，脂质一次氧化所需的Ea范围在22.66～30.91 kJ/mol之间，并且随着电压强度的增加，脂质一次氧化所需的Ea与电压强度呈明显的线性关系，具体为y＝－0.171 6x＋35.713（R2＝0.979 9），即脂质一次氧化所需Ea与电压强度呈显著的负相关。
为了进一步深入研究低温等离子体不同处理条件对肌肉脂质一次氧化速率的影响，借助阿伦尼乌斯方程来研究低温等离子体处理条件对肌肉中脂肪一次氧化Ea的影响。参与化学反应的分子必须吸收足够的能量先变成活化分子，而使每摩尔普通分子变成活化分子所需的能量即为Ea[26]。Ea越高，表明化学反应越难发生，反应速率越慢；相反则表明化学反应越容易进行，反应速率越快。随着低温等离子体处理时间的延长，脂质一次氧化所需Ea呈现先增加后降低的抛物线变化趋势；电压强度的增加可以降低脂质一次氧化所需Ea，从而提高其初始氧化的速率。运用低温等离子体设备处理生鲜猪肉肌肉脂质，脂质更容易发生一次氧化，因此高压电场低温等离子体处理或可作为促进脂质一次氧化的一项新技术。
2.2.1 处理时间及贮藏温度对TBARS含量的影响
图3 处理时间及贮藏温度对TBARS含量的影响
Fig.3 Effect of processing time and storage temperature on TBARS content
如图3所示，与对照组（处理时间0 s）相比，在不同贮藏温度下，不同处理时间均可显著促进肌肉脂质中丙二醛的累积（P＜0.05），具体表现为4 ℃贮藏与50 ℃贮藏处理组中，肌肉的TBARS含量随处理时间的延长而呈现显著的上升趋势；20～40 ℃贮藏处理组的TBARS含量均在低温等离子体处理40～60 s时出现略微的下降。该现象可能是由于低温等离子体具有改性薄膜材料的特点[27]，一定时间的低温等离子体处理可在薄膜表面引入—NH2、üCOOH、—OH等极性基团，减小空间电荷积聚[28]，提高其在高压电场中的耐电晕能力；2.1.3.1节中发现当处理时间在43.8 s时，肌肉中脂质一次氧化所需的Ea最高，即过氧化物产生速率最低，产生这种变化趋势的主要原因可能是由于过氧化物积累到一定程度会进一步氧化形成醛、醇、酮等二级氧化产物[29]，与图3中TBARS含量在40 s时出现峰值一致。另外，固定低温等离子体处理时间可以看出，肌肉脂质中TBARS含量随温度升高明显提高，与POV变化趋势相同。
2.2.2 电压强度及贮藏温度对TBARS含量的影响
图4 电压强度及贮藏温度对TBARS含量的影响
Fig.4 Effect of voltage and storage temperature on TBARS content
从图4中可以看出，与POV变化趋势相似，在不同贮藏温度下随着电压强度的增加，脂质TBARS含量呈显著增加趋势，并且当电压强度在50～80 kV时，TBARS含量增加趋势明显提高。另外，在电压强度为30～80 kV时，贮藏温度的升高能显著促进脂质中丙二醛的累积，从而增加脂质二次氧化的程度。
分析图3、4数据，在低温等离子体处理0～80 s和30～80 kV时，可通过计算分别得到不同贮藏温度下处理1 s和1 kV所积累的TBARS含量，同一次氧化结果相似，在实验范围内电压强度对脂质二次氧化的影响大于处理时间。
肌肉中脂质二次氧化的程度通常用TBARS含量表示，以丙二醛为代表的反映脂质氧化形成的化合物含量的多少[30]。丙二醛是一种致癌物的引发剂和有机体突变的诱变剂，对人体有害，因此TBARS含量常被用来评价食品氧化变质的程度[31]，并且当生鲜肉中TBARS含量超过0.5 mg/kg时，即可产生不良风味。从表观上分析低温等离子体处理时间、电压强度及贮藏温度对脂质二次氧化的影响结果，低温等离子体处理可以显著增加脂质中丙二醛的累积，并且随着低温等离子体处理时间的延长、电压强度增加及贮藏温度的升高，TBARS含量明显增加。相对于处理时间，低温等离子体电压强度对生鲜猪肉脂质氧化的影响更大。
2.2.3 低温等离子体处理条件对脂质二次氧化Ea的影响
2.2.3.1 处理时间对脂质二次氧化Ea的影响
分析图3中数据，通过阿伦尼乌斯方程计算得到不同处理时间条件下二次氧化k与T之间关系如下：处理时间为20 s时，y＝－4 074.4x＋11.432（R2＝0.987 5）；处理时间为40 s时，y＝－3 106.7x＋9.132 6（R2＝0.984 0）；处理时间为60 s时，y＝－2 717.2x＋7.780 3（R2＝0.942 4）；处理时间为80 s时，y＝－2 291.2x＋6.589（R2＝0.954 8）。
当低温等离子体处理时间为0～80 s时，ln k与1/T线性关系方程的R2均大于0.900 0，不同处理时间脂质二次氧化的Ea为19.05～41.57 kJ/mol。随着处理时间的延长，脂质二次氧化所需的Ea逐渐降低，低温等离子体处理时间与脂质二次氧化反应速率呈明显的线性关系，具体为y＝－0.238 6x＋37.265（R2＝0.947），即脂质二次氧化所需Ea与处理时间呈显著的负相关。
2.2.3.2 电压强度对脂质二次氧化Ea的影响
分析图4中数据，代入阿伦尼乌斯方程，以1/T为横坐标，ln k为纵坐标作图拟合分析，可得到不同处理电压条件下二次氧化k与T之间关系如下：处理电压为30 kV时，y＝－3 410.7x＋9.304 1（R2＝0.984 8）；处理电压为40 kV时，y＝－3 224.9x＋8.881 7（R2＝0.970 2）；处理电压为50 kV时，y＝－2 911.8x＋8.036（R2＝0.964 6）；处理电压为60 kV时，y＝－2 346.9x＋6.429 1（R2＝0.976 2）；处理电压为70 kV时，y＝－2 308.9x＋6.521 7（R2＝0.972 5）；处理电压为80 kV时，y＝－2 124.2x＋6.270 1（R2＝0.986 3）。
在不同电压强度下，ln k与1/T呈明显的直线关系，并且R2均大于0.950 0。当电压强度在30～80 kV时，脂质二次氧化所需的Ea范围在17.66～28.36 kJ/mol之间，随着电压强度增加，Ea呈明显的下降趋势，电压强度对脂质二次氧化Ea的影响趋势与处理时间对其的影响趋势相似，也呈现线性负相关，具体为y＝－0.231 5x＋35.375（R2＝0.947 5）。
图5 处理时间与脂质氧化所需Ea之间的函数关系
Fig.5 Functional relationship between Ea and processing time
图5 中y1和y2分别为处理时间与猪肉中脂质一次、二次氧化所需Ea的函数关系，对比分析y1、y2可以看出，当处理时间为20.0～30.7 s时，脂质一次氧化所需的Ea低于二次氧化，即脂质中更容易发生一次氧化；而随着处理时间的延长（30.7～80.0 s），脂质中更容易发生二次氧化。
图6中y3和y4分别为处理电压与猪肉中脂质一次、二次氧化所需Ea的函数关系，电压强度每增加10 kV时，脂质二次氧化Ea降低约2.315 kJ/mol，而脂质一次氧化Ea仅降低约1.716 kJ/mol。因此，低温等离子体电压强度促进脂质二次氧化的程度明显高于一次氧化。且在30～80 kV范围内，二次氧化所需的Ea均低于一次氧化，进一步证明不同电压强度下，肌肉脂质更容易发生二次氧化。另外，比较y2和y4斜率，在低温等离子体处理20～80 s和30～80 kV时，处理时间和电压强度对降低脂质二次氧化所需Ea的效果相差不大。
图6 处理电压与脂质氧化所需Ea之间的函数关系
Fig.6 Functional relationship between Ea and voltage
综合上述结果可以得出，在电压强度为30～80 kV、处理时间为30.7～80.0 s时，二次氧化所需的Ea明显低于一次氧化，即在该处理条件下，脂质更容易发生二次氧化。
低温等离子体冷杀菌处理时间、电压强度及贮藏温度对肌肉脂质一次及二次氧化均有显著的促进作用，并且电压强度对脂质氧化的影响较大。低温等离子体冷杀菌处理时间的延长及电压强度的增加均可降低脂质二次氧化所需的Ea；脂质一次氧化所需Ea随电压强度的增加而降低，随处理时间的延长呈现先增加后降低的抛物线变化趋势，在43.8 s时，一次氧化所需的Ea最高，为30.84 kJ/mol，是导致低温等离子体处理40 s时TBARS含量出现峰值的原因之一。在电压强度为30～80 kV、处理时间为30.7～80.0 s时，肌肉脂质二次氧化所需Ea低于一次氧化，其更容易发生二次氧化。高压电场低温等离子体冷杀菌设备处理生鲜猪肉脂质容易发生氧化，适用于低温贮藏短时处理猪肉产品。
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Impact of Cold Plasma Cold Sterilization Processing Time and Voltage on Fresh Pork Lipid Oxidation
第一作者简介：孟婧怡（1993—）（ORCID: 0000-0001-5094-6505），女，硕士研究生，研究方向为畜产品加工与质量控制。E
mail: 2015108076@njau.edu.cn
章建浩（1961—）（ORCID: 0000-0001-6354-7642），男，教授，博士，研究方向为畜产品加工与质量控制。E
mail: nau_zjh@njau.edu.cn
严文静（1986—）（ORCID: 0000-0002-0721-9414），女，副教授，博士，研究方向为纳米抑菌保鲜、等离子体冷杀菌技术。E
mail: ywj1103@njau.edu.cn