碳量子点（carbon quantum dots，CQDs）是一种粒径小于10 nm、微观近乎准球形、表面富含有机官能团、具有荧光性能的新型碳纳米材料。由于CQDs具有环保、低成本、易制备和良好的生物相容性、光学稳定性等优点[1]，其在生物成像、生物传感、催化、纳米医学、检测等方面显示了巨大的应用潜能。有研究表明，活性氧（reactive oxidative species，ROS）自由基特别是羟自由基（·OH）是很强的氧化剂，如果体系中产生·OH，CQDs表面的结构会发生改变，其荧光会被猝灭[2]。CQDs的合成方法分为top-down和bottom-up两大类[1]。Top-down方法是指CQDs由较大的碳结构材料形成或剥离形成，包括电弧切割法、激光消融法、电化学法和氧化法等。Bottom-up方法是指由分子前驱物形成CQDs，主要包括煅烧或加热法、微波合成法、载体合成法以及水热合成法等。经过10多年的研究和发展，CQDs的合成技术趋向于成熟，材料的使用也越来越简单和绿色。最近，利用微波辅助水热合成法制备CQDs的研究层出不穷，但是这些研究中所使用的微波设备都是家用微波炉，存在着一定的安全隐患和制备条件不可控等缺点[3]。
表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是茶叶中儿茶素类化合物的主要成分，占绿茶中儿茶素总量的50%～75%[4]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗动脉硬化、抗菌、抗炎症、预防癌症、预防心脑血管疾病等多种生物活性[4-7]，深受医学、营养学学科国内外研究者的广泛关注。许多研究者认为EGCG分子含有多个酚羟基的特殊分子结构，具有良好的抗氧化活性，能够清除自由基、减少活跃金属离子的破坏作用、激活某些酶及相关的活性因子，在生物机体中具有重要的作用。但是，也有研究表明，EGCG不仅具有抗氧化作用，在一定的条件下还表现出促氧化活性，比如其在金属离子（Cu2+、Fe3+）催化下易被转化成反应活性较高的醌式中间体，体系中还伴随着H2O2、·OH、超氧阴离子自由基（
·）等ROS的产生[8-9]，这些ROS自由基对癌细胞具有很好的杀伤作用，同时还能够对生物分子进行共价修饰，表现出一定的生物毒性[10-12]。但是细胞内的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等会对过量的自由基进行清理，使细胞中的自由基处于动态平衡状态[13]。然而，不同的细胞类型所含有的过渡金属离子浓度是不同的，已有研究报道恶性肿瘤细胞中的Cu2+浓度会高于正常细胞[14]。因此，很多研究者认为EGCG的抗肿瘤作用是通过促氧化作用机制产生的[9]。但在EGCG的促氧化作用过程中，EGCG和Cu2+的剂量-效应关系至今少有研究。
本研究通过高通量微波消解/萃取工作站制备CQDs，并以此为探针研究EGCG与Cu2+之间的促氧化作用及其剂量-效应关系，以期为EGCG的功能性应用提供理论依据。
EGCG（分析纯） Sigma-Aldrich（上海）试剂有限公司；H2SO4、NaOH、乙二胺四乙酸二钠（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）（分析纯） 广州精科生物有限公司；二甲基亚矾（dimethyl sulfoxide，DMSO）（分析纯） 阿拉丁（上海）试剂有限公司；MD 31 mm透析袋（截留分子质量100～500 Da） 上海源叶生物科技有限公司；实验用水为实验室制备的超纯水。
JUPITER-B型高通量微波消解/萃取工作站 上海新仪微波化学科技有限公司；RF-6000型荧光分光光度计、UV-1800型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Tensor 27型傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 德国Bruker公司；JEM-1400 Plus型透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM） 日本JEOL公司。
1.3.1 CQDs的制备和相对量子产率的测定
CQDs的制备参考文献[15]的方法并稍作调整，采用微波辅助法。将2 g一水合柠檬酸和0.954 mL乙二胺充分溶解在20 mL超纯水中，充分搅拌混匀后转移到100 mL聚四氟乙烯反应釜中，在200 ℃、500 W下反应5 min。反应结束后自然冷却至室温。用0.22 μm微孔滤膜将反应液过滤，将滤液用截留分子质量100～500 Da的透析袋透析24 h后放置于棕色瓶中，于4 ℃冰箱中保存备用。
参照文献[16]的方法测定CQDs的相对量子产率（quantum yields，QYs），测得所制备好的CQDs的相对量子产率为73.67%。具体方法如下：将硫酸奎宁溶解于配制好的0.1 mol/L硫酸溶液中，调节硫酸奎宁溶液和CQDs水溶液的浓度，使硫酸奎宁溶液和CQDs水溶液分别在360 nm和350 nm波长处的吸光度均小于0.1。配制该吸光度下的待测试样，用荧光分光光度计分别测定该硫酸奎宁溶液和CQDs水溶液在360 nm和350 nm激发波长处的发射光谱，根据荧光光谱计算荧光峰面积，即积分荧光强度。硫酸奎宁在360 nm激发波长处的量子点产率为54%。根据公式（1）计算CQDs的相对量子产率。
式中：QYs和QYst分别表示CQDs和硫酸奎宁的相对量子产率/%；Is和Ist分别表示CQDs和硫酸奎宁的荧光积分面积；As和Ast分别表示CQDs和硫酸奎宁的吸光度；ηs表示CQDs溶剂（水）的折射率（1.33）；ηst表示硫酸奎宁溶剂（硫酸）的折射率（1.33）[16]。
1.3.2 CQDs的表征
利用Nanomeasure软件测定CQDs的粒径；采用UV-1800型紫外-可见分光光度计扫描CQDs的吸收光谱；采用RF-6000型荧光分光光度计测定CQDs的激发光谱和发射光谱，激发波长350 nm、发射波长440 nm、狭缝宽度3 nm；采用JEM-1400 Plus型TEM观察CQDs的形貌和粒径；采用Tensor 27型FTIR仪分析CQDs的表面基团：将适量冷冻干燥CQDs粉末加入到适量KBr粉末中，在玛瑙研钵中充分碾磨，混合均匀后压片制样测定，扫描范围4 000～500 cm-1。
1.3.3 CQDs的性质测定
1.3.3.1 pH值对CQDs发光性能的影响
不同pH值（pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11）的CQDs溶液均用0.1 mol/L H2SO4和0.1 mol/L NaOH溶液调节，并用pH计测定，室温下用荧光分光光度计在350 nm激发波长处测其荧光强度，观察其荧光强度的变化。
1.3.3.2 贮藏条件对CQDs发光性能的影响
将CQDs原液和稀释105 倍体积的CQDs溶液各分为3 份，每份5 mL，设置3 个平行，分别在-4 ℃冰箱内避光、常温下避光、常温下不避光的环境下放置不同时间（0、1、8、15、23、30 d）。测定时将CQDs原液稀释105 倍体积后，室温下用荧光分光光度计在350 nm激发波长处测相应放置时间CQDs的荧光强度，稀释后的CQDs溶液在室温下直接测定，观察其荧光强度的变化。
1.3.4 不同浓度的EGCG和Cu2+对CQDs荧光猝灭效果的测定
在4 mL塑料离心管中依次加入1 mL稀释105 倍体积的CQDs溶液、900 µL不同浓度的Cu2+溶液和100 µL 250 µmol/L EGCG溶液，使体系中Cu2+与EGCG的浓度比分别为1∶2、1∶1、2∶1、4∶1，用混匀器混合均匀后，在40 ℃水浴锅中水浴30 min，用荧光分光光度计在350 nm激发波长处测其荧光强度。反应体系最终浓度为12.5 μmol/L EGCG和6.25、12.5、25、50 μmol/L Cu2+。根据公式（2）[17]计算CQDs荧光猝灭率（I）。
式中：Ia表示CQDs溶液中加入相应浓度Cu2+时的荧光强度；Ib表示CQDs溶液中加入相应浓度Cu2+和EGCG时的荧光强度。
在4 mL塑料离心管中依次加入1 mL稀释105 倍体积的CQDs溶液、100 µL 1 mmol/L Cu2+溶液和900 µL不同浓度的EGCG溶液，使反应体系最终浓度为50 μmol/L Cu2+和6.25、12.5、25、50 μmol/L EGCG。其他操作同上，根据公式（2）计算CQDs荧光猝灭率。式中：Ia为CQDs溶液中加入相应浓度EGCG溶液时的荧光强度；Ib为CQDs溶液中加入相应浓度EGCG和Cu2+溶液时的荧光强度。实验平行测定3 次。
1.3.5 DMSO/EDTA-2Na对CQDs的荧光保护作用
在4 mL塑料离心管中依次加入1 mL稀释105 倍体积的CQDs溶液、400 µL超纯水、200 µL 1 mmol/L Cu2+溶液、200 µL 14.08 mmol/L DMSO溶液（或2 mmol/L EDTA-2Na溶液）、200 µL 500 µmol/L EGCG溶液，用混匀器混合均匀后在40 ℃水浴锅中水浴30 min，用荧光分光光度计在350 nm激发波长处扫描其发射光谱，实验平行测定3 次。
利用Origin和Omnic软件对光谱图进行分析及作图；用Excel软件进行数据分析。
图 1 CQDs的紫外-可见吸收光谱、荧光发射光谱和激发光谱（a）、TEM图（b）和FTIR图（c）
Fig. 1 Normalized UV-vis absorption, fl uorescence emission and excitation spectra (a), transmission electron microscopy image (b), and Fourier transform infrared spectroscopy spectra (c) of CQDs
本研究制备的CQDs具有安全、快捷等优点，且相对量子产率（73.67%）较高，与普通水热法（80%）[18]基本持平；但是普通水热法需要反应18 h，而通过微波消解工作站只需要反应5 min，一次性就可制备960 mL CQDs溶液。由图1a的紫外-可见吸收光谱可以看出，所合成的CQDs溶液的吸收主要都在紫外光区，而在可见光区的吸收则比较弱，在波长238 nm附近出现了肩峰，348 nm波长处出现了宽的吸收峰。波长238 nm处的肩峰归因于芳香C＝C键的π-π*跃迁，而在348 nm波长处宽的吸收峰归因于C＝O键的n-π*跃迁[15,18]。由荧光光谱图可以看出，该CQDs最佳激发波长和发射波长分别为350 nm和445 nm，手持紫外灯照射下发出蓝色荧光。由图1b可以看出，该CQDs类似球形，少部分呈不规则状态，在水相中的分散性较好，但粒径分布不太均匀，平均粒径约为6 nm。为了探究该CQDs表面修饰的官能团，对其进行FTIR分析（图1c）。在3 200～3 750 cm-1和2 900～3 050 cm-1处的峰可分别归因于C—OH和C—H的伸缩振动；N—H的拉伸和弯曲振动分别出现在3 100～3 300 cm-1和1 552 cm-1处；1 656、1 150 cm-1处的峰分别表明存在C＝O和C—NH—C。由此可见，通过微波消解工作站制备得到的CQDs的结构和粒径与文献[15,18-19]基本一致。通过FTIR图谱可以发现，CQDs表面含有羧基和氨基等含氮和含氧官能团，其表面被成功修饰了来源于乙二胺的氨基。这些官能团的存在大大增加了CQDs的水溶性[18]。
2.2.1 pH值对CQDs发光性能的影响
图 2 pH值对CQDs荧光强度的影响
Fig. 2 Effect of pH on the fl uorescence intensity of CQDs
CQDs的荧光强度具有pH值依赖性，微波辅助高通量制备的CQDs同样具有这个特点。由图2可以看出，CQDs在高pH值或低pH值溶液中荧光强度较低，但在pH 4～10的溶液中荧光强度基本保持恒定，不随pH值的变化而变化。这与普通水热法制备的CQDs基本一致[18]。这可能归因于CQDs化学结构的变化或边缘卡宾结构的三重态[18,20-21]，CQDs的表面状态/分子状态受溶液pH值的影响，太高或太低的pH值都会使CQDs表面的分子基团受到强烈的影响，大部分的CQDs没有石墨晶格，导致荧光猝灭；在强酸性条件下，CQDs的卡宾结构锯齿点被质子化，导致发光的三重态卡宾结构被破坏，发生荧光猝灭；而在中性或弱碱性情况下，CQDs的卡宾结构较稳定，荧光强度基本保持不变；但在强碱溶液中，CQDs表面的分子团会受到强烈的影响，表面结构被破坏，导致荧光猝灭。本实验用超纯水作溶剂，微量的EGCG和Cu2+不会对体系pH值产生明显的影响。
2.2.2 贮藏条件对CQDs发光性能的影响
图 3 CQDs原液（a）、稀释液（b）贮藏过程中荧光强度变化趋势
Fig. 3 Effect of storage time on the fl uorescence intensity of stock (a)and diluted (b) CQDs
为研究CQDs的贮藏稳定性，利用CQDs在不同条件下贮藏1 个月后荧光强度的变化情况来探究CQDs的稳定性。由图3可以看出，CQDs原液比较稳定，随着贮藏时间的延长，-4 ℃避光、常温不避光、常温避光贮藏组的荧光强度都基本保持不变，说明CQDs原液贮藏1 个月中温度和光照对其影响不大。但是稀释后的CQDs稳定性则有所差异，不同的贮藏条件影响效果不同。-4 ℃避光和常温避光贮藏1 个月，CQDs的荧光强度基本保持不变；而常温不避光条件下贮藏则使CQDs荧光强度明显下降，30 d后约下降了74%。出现这一现象的原因可能是CQDs原液稀释了105 倍体积，溶液中含有的CQDs较少，随着贮藏时间的延长，稀释后的CQDs受到光照的强烈影响发生团聚或衰减，导致荧光强度明显下降。因此，制备好的CQDs最好在-4 ℃避光条件下以原液贮藏。
已有研究表明，EGCG在Cu2+等金属离子作用下会选择性地转变成促氧化剂，体系中发生类似Fenton反应，产生·OH等ROS自由基[9,22-23]。另外有研究发现，体系中产生的ROS自由基能够改变CQDs的表面状态并导致荧光猝灭[15,24]。因此，本研究以CQDs为荧光探针，研究EGCG和Cu2+是否会猝灭CQDs荧光探针。由图4可以看出，CQDs溶液中单独加入100 µmol/L Cu2+或50 µmol/L EGCG，体系中CQDs的荧光强度变化不大；但在EGCG与Cu2+共同作用时，CQDs的荧光强度大幅下降，但没有出现明显的偏移现象。这可能归因于EGCG和Cu2+之间的反应，Cu2+作为催化剂加速了EGCG自动氧化生成相应的半醌自由基和Cu+，半醌自由基被迅速氧化成相应的醌，而Cu+通过单电子转移给O2氧化生成O2-·；同时，溶液体系中伴随着H2O2的生成，Cu+与H2O2间发生类似Fenton反应，产生·OH，从而使CQDs荧光探针猝灭[15,22,25-26]。
图 4 CQDs在Cu2＋及EGCG作用下的荧光猝灭作用
Fig. 4 Fluorescence quenching of CQDs in the presence of Cu2+ and EGCG
图 5 CQDs在Cu2＋、EGCG及DMSO（a）/EDTA（b）作用下的荧光强度
Fig. 5 Fluorescence intensity of CQDs in the presence of Cu2＋, EGCG and DMSO (a)/EDTA (b)
为了进一步验证EGCG是否在一定量的Cu2+存在下转变成促氧化剂，产生·OH，从而猝灭CQDs荧光探针，选择DMSO作为自由基清除剂、EDTA-2Na作为Cu2+的螯合剂[27]。如图5所示，当体系中加入DMSO或EDTA时，CQDs荧光探针得到了一定的保护，加入1.408 mmol/L DMSO时，体系中荧光强度大约恢复了55%，这是由于DMSO不是很好的自由基清除剂[27]，所以不能完全清除EGCG和Cu2+所产生的自由基，因此CQDs荧光探针在一定程度上有所猝灭；但是当加入200 µmol/L EDTA时，CQDs荧光探针的荧光强度基本得到保护，少量的CQDs荧光探针猝灭，这是因为EDTA是很好的金属螯合剂，使体系中游离的Cu2+减少，EGCG在没有游离Cu2+存在的条件下促氧化作用受到抑制。由此说明，CQDs荧光探针的猝灭是由于EGCG在一定量的Cu2+存在下产生ROS自由基引起的。
图 6 Cu2＋与EGCG浓度比对CQD荧光强度的影响
Fig. 6 Effect of concentration ratio between Cu2+ and EGCG on the fl uorescence intensity of CQDs
为了进一步研究EGCG和Cu2+之间的剂量-效应关系，了解EGCG在Cu2+存在下的促氧化性质，研究EGCG和Cu2+浓度比对CQDs荧光探针猝灭的影响。由图6a可以看出，固定EGCG浓度为12.5 µmol/L，不断增加Cu2+浓度，当Cu2+和EGCG的浓度比为2∶1时，CQDs的荧光猝灭效果最明显，继续增加Cu2+的浓度，CQDs荧光探针的猝灭率无明显的增加。当EGCG的浓度为50 µmol/L或者25 µmol/L时，随着Cu2+浓度的不断增加，同样得到类似的结果。如图6b所示，固定Cu2+浓度，随着EGCG浓度的增加，体系中CQDs荧光探针猝灭效果先明显升高后逐渐降低并趋于平缓。当Cu2+和EGCG的浓度比为2∶1，即EGCG浓度为25 µmol/L、Cu2+浓度为50 µmol/L或EGCG浓度为12.5 µmol/L、Cu2+浓度为25 µmol/L时，CQDs的荧光强度猝灭效果最明显。继续增加EGCG浓度，荧光猝灭效果降低。由此可以得出，Cu2+浓度是EGCG的2 倍时EGCG表现出更强的促氧化作用。
Hayakawa等[28]在1997年报道了茶多酚在Cu2+作用下对DNA和亚油酸的氧化作用，提出了自由基产生的反应式（式（3）～（6）），从反应式中可以看出1 个茶多酚与2 个分子的Cu2+作用，产生ROS自由基，但是在他们的实验中所使用的Cu2+浓度和茶多酚浓度并没有产生与本研究类似的剂量-效应关系。而本研究通过CQDs荧光探针可以清晰地看到Cu2+和EGCG浓度的剂量-效应关系，即EGCG在Cu2+存在的条件下表现出促氧化作用，而在Cu2+浓度是其2 倍的情况下表现出更强的促氧化作用，验证了Hayakawa等[28]提出的儿茶酚在Cu2+作用下的自由基产生机制。
EGCG在Cu2+的作用下自动氧化生成Cu+和半醌自由基。Cu+和H+在O2的作用下反应生成H2O2。H2O2在金属离子Cu+的作用下发生了类似的Fenton反应，产生·OH等ROS自由基[7,10]。ROS自由基会立即攻击CQDs的表面官能团，使CQDs表面结构发生改变，从而使荧光猝灭[2]。一些抗氧化物质如其他茶多酚（表没食子酸儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、儿茶素）[28]、白藜芦醇[29]及其类似物，苯环上具有多羟基官能团结构的物质，当它们遇到一定量的Cu2+时也会产生促氧化作用，产生·OH等ROS自由基[30]。通过CQDs荧光探针可快速预知这些抗氧化物质在过渡金属离子（如Cu2+等）存在下的促氧化性质。
本研究通过高通量微波消解/萃取工作站快速制备高相对量子产率的类似球形的水溶性荧光CQDs，研究了CQDs的pH值依赖性及其稳定性。另外，以此CQDs为荧光探针，研究了EGCG在Cu2+存在条件下产生的ROS自由基对CQDs荧光探针的猝灭作用，同时探讨了EGCG和Cu2+的促氧化剂量-效应关系，即当Cu2+和EGCG的浓度比为2∶1时，体系中的荧光猝灭效果最明显，EGCG的促氧化作用更强。本研究结果为CQDs的合成提供了新的方式，同时也为EGCG作为功能性物质的应用提供理论依据。
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Rapid Microwave-Assisted Preparation of Carbon Quantum Dots and Its Application for Investigating Pro-oxidative Activity of Epigallocatechin-3-gallate
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