图 1 p-辛弗林结构
Fig. 1 Structure of p-synephrine
p-辛弗林（p-synephrine）为酸橙（Citrus aurantium）、中药枳实（Fructus Aurantii Immaturus）中的主要成分（图1）[1-3]。据《名医别录》、《本草纲目》等中医药书籍记载，枳实有破气消积、化痰散痞、理气宽中、行滞消胀等功效。美国食品药品监督管理局禁止膳食补充剂中添加麻黄碱，p-辛弗林由于结构与内源性神经递质如肾上腺素和去甲肾上腺素相似，具有促进能量消耗、抑制食欲、提高代谢和产热等作用[4]，可以替代麻黄碱发挥减肥功效[5-6]。
图 1 p-辛弗林结构
Fig. 1 Structure of p-synephrine
作为减肥促进剂，p-辛弗林现已发现在外周组织中有很多作用，包括促进脂肪组织发生脂质分解，增加生热作用[7]；增加肝细胞内cAMP含量，促进葡萄糖的呼吸作用[8-9]；刺激肌肉组织中腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）磷酸化，诱导肌细胞葡萄糖的消耗等[10]。这些结果显示，p-辛弗林具有潜在的抗高血糖的活性。本研究在此基础之上，探讨p-辛弗林对肝细胞葡萄糖生成的影响及其具体作用机制。
人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库。
p-辛弗林（纯度≥98%）、葡萄糖分析试剂盒、AMPK抑制剂Dorsomorphin（Compound C） 美国Sigma-Aldrich公司；CellTiter 96 AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒 美国Promega公司；DMEM培养基、胎牛血清 美国Gibco公司；磷酸化AMPK（p-AMPK）、AMPKα1/2、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl coenzyme A synthetase，ACC）、磷酸化ACC（p-ACC）、叉头框转录因子1（forkhead box class O1，FoxO1）、磷酸化FoxO1（p-FoxO1）等特异性抗体 美国CST公司；AMPK siRNA 美国Santa Cruz公司；FuGENE® HD转染试剂 瑞士Roche公司。
二氧化碳培养箱 美国Thermo Fisher公司；酶标仪瑞士TECAN公司；ChemiDoc XRS系统 美国Bio-Rad公司。
1.3.1 细胞培养和细胞活力检测
人肝癌HepG2细胞株于高糖DMEM培养基（含体积分数10%胎牛血清、100 单位/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）中，5% CO2、37 ℃培养箱内培养。
取对数生长期的人肝癌HepG2细胞（5×103 个/孔）接入到96 孔板中，细胞过夜贴壁，加入终浓度为1、10、50、100、200 μmol/L的p-辛弗林作用24 h后，每孔加入20 μL MTS试剂，在培养箱中继续孵育1～4 h，用酶标仪于490 nm波长处读取吸光度，分析细胞活力[11-12]。
1.3.2 葡萄糖生成检测
取对数生长期的人肝癌HepG2细胞（2×105 个/孔）接入24 孔板中，细胞过夜贴壁后，换用不含血清的培养基继续培养，同时加入终浓度为0.1、1、10、100 μmol/L的p-辛弗林或100 nmol/L胰岛素（阳性对照）作用细胞6 h，然后用磷酸盐缓冲液漂洗2 次，去掉培养基中的葡萄糖，接着用不含葡萄糖和酚红的DMEM继续培养3 h后，收集上清液，利用葡萄糖分析试剂盒测定葡萄糖的质量浓度，葡萄糖相对生成量以占对照组（未加入p-辛弗林或胰岛素）的比例表示[13]。
当检测AMPK信号通路在p-辛弗林抑制肝细胞葡萄糖生成中的作用时，在孵育p-辛弗林前先孵育AMPK抑制剂Compound C（20 μmol/L）1 h，再加入p-辛弗林继续孵育6 h后，然后按照上述方法检测葡萄糖相对生成量、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）、磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）活力等指标。
1.3.3 Western blot蛋白印迹检测蛋白表达
取对数生长期的人肝癌HepG2细胞（2×106 个/孔）接入到6 孔板中，细胞过夜贴壁后，换用不含血清的培养基继续培养，同时加入终浓度为0.1、1、10、100 μmol/L的p-辛弗林作用细胞6 h，磷酸盐缓冲液漂洗2 次，冰上裂解药物作用后的HepG2细胞，二喹啉甲酸法测定总蛋白质质量浓度，上样总蛋白质量为50 μg，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转蛋白至聚偏氟乙烯膜，用TBST配制的质量分数5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h，然后按体积比1∶1 000加入各蛋白一抗抗体（p-AMPK、AMPKα1/2、p-ACC、ACC、p-FoxO1、FoxO1），室温孵育2 h，TBST漂洗3 次后加入HRP标记的二抗（体积比1∶2 000），室温孵育2 h，TBST漂洗3 次，ECL法显影，ChemiDoc XRS采集图像。Quantity One软件对蛋白印迹分析，实验以肌动蛋白（Actin）为内参，结果以磷酸化比例表示[14]。
1.3.4 酶活力检测
G6Pase活力检测：收集药物作用后的HepG2细胞于裂解液（20 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、250 mmol/L蔗糖、10 μmol/L蛋白酶抑制剂，pH 7.0）中，冰上超声裂解10 min。然后4 ℃、12 000×g离心20 min，收集上清液以最大转速继续离心60 min，沉淀物于200 μL反应液（20 mmol/L葡萄糖-6-磷酸、50 mmol/L Tris-二甲砷酸盐缓冲液，pH 6.5）中重悬，35 ℃孵育20 min。加200 μL终止液（0.36 mmol/L钼酸铵、质量分数10%十二烷基硫酸钠、1 mmol/L H2SO4、质量分数1.4%抗坏血酸）终止反应，然后45 ℃继续孵育30 min，用酶标仪于820 nm波长处测吸光度[15]。
PEPCK活力检测：收集药物作用后的HepG2细胞于裂解液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、250 mmol/L蔗糖、50 μmol/L KCl，pH 7.2）中，冰上超声裂解，然后4 ℃、10 000×g离心30 min。测定总蛋白质量浓度。100 μg总蛋白中加入反应缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L MnCl2、2.5 U/mL苹果酸脱氢酶和还原型的NADH），加入0.4 mmol/L脱氧鸟苷-5’-二磷酸开始反应，用酶标仪于340 nm波长处测吸光度[16]。
1.3.5 siRNA的瞬时转染及干扰效率分析
取对数生长期的HepG2细胞（2×106 个/孔）接入到6 孔板中，待细胞贴壁后，用不同浓度AMPKα1/2的siRNA质粒转染细胞，转染步骤根据FuGENE® HD转染试剂说明书进行。
在用siRNA转染24 h后，收集细胞提取总蛋白，Western蛋白印迹分析干扰效率，筛选建立瞬时干扰AMPK表达的细胞，然后再比较正常HepG2细胞（空白组）、转染空质粒HepG2细胞（阴性空质粒组）及基因敲除AMPK的HepG2细胞（AMPK siRNA组）的葡萄糖相对生成量、G6Pase、PEPCK活力等指标。
实验数据均以
±s表示，统计分析使用Origin 8.0软件进行分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用ANOVA检验，采用Pearson相关性分析法分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
图 2 p-辛弗林对人肝癌HepG2细胞活力的影响（n＝8）
Fig. 2 Effect of p-synephrine on HepG2 cell viability (n = 8)
由图2可知，不同浓度的p-辛弗林作用人肝癌HepG2细胞24 h后，细胞活力无显著性改变（P＞0.05），提示直到作用浓度为200 μmol/L时，p-辛弗林也没有损伤细胞的完整性；因此，在后续实验中，采用0～100 μmol/L的p-辛弗林进行肝细胞葡萄糖生成研究。
图 3 p- 辛弗林对人肝癌HepG2细胞葡萄糖生成的影响（n＝5）
Fig. 3 Effect of p-synephrine on glucose production in HepG2 cells (n = 5)
通过测定HepG2细胞葡萄糖生成的情况来反映p-辛弗林对肝细胞葡萄糖代谢的影响。如图3所示，在0.1～100 μmol/L的p-辛弗林作用HepG2细胞6 h后，肝细胞葡萄糖生成呈浓度依赖性降低。提示p-辛弗林能抑制HepG2细胞葡萄糖生成。
为了研究p-辛弗林对肝细胞葡萄糖异生关键蛋白潜在的影响，本研究检测了细胞能量平衡传感器AMPK信号通路中AMPK、ACC磷酸化水平及下游转录因子FoxO1磷酸化变化[17]。如图4A、B所示，与对照组相比较，p-辛弗林作用6 h后，AMPK、ACC、FoxO1的磷酸化比例都呈浓度依赖性增加。10 μmol/L的p-辛弗林作用后，AMPK、ACC、FoxO1的磷酸化比例分别为对照组的2.5、3.4 倍和2.3 倍。G6Pase和PEPCK活力也呈浓度依赖性降低（图4C、D）。
图 4 p-辛弗林对人肝癌HepG2细胞AMPK-FoxO1信号通路及其葡萄糖异生相关酶活力的影响
Fig. 4 Effect of p-synephrine on AMPK-FoxO1 signaling pathway and the activities of gluconeogenic enzymes in HepG2 cells
AMPK信号通路中的AMPK是肝脏糖异生的关键因子。本研究利用AMPK信号通路抑制剂Compound C进一步考察AMPK信号通路在p-辛弗林抑制肝细胞葡萄糖生成中的作用。
图 5 AMPK信号通路在p-辛弗林抑制肝细胞葡萄糖生成中的作用（n＝10）
Fig. 5 Effect of p-synephrine on glucose production and gluconeogenic enzymes in the presence of Compound C in HepG2 cells (n = 10)
如图5所示，提前用20 μmol/L Compound C孵育HepG2细胞能够极显著抑制p-辛弗林对肝细胞葡萄糖生成、G6Pase和PEPCK活力的抑制作用（P＜0.01）。
除了信号通路抑制剂的应用，本研究还利用了AMPK siRNA干扰质粒转染到HepG2肝细胞中[13,18]，干扰细胞中AMPK的表达，再次考察AMPK信号通路在p-辛弗林抑制肝细胞葡萄糖生成中的作用。
图 6 p-辛弗林对基因敲除AMPK的HepG2肝细胞葡萄糖生成的影响
Fig. 6 Effect of p-synphrine on glucose production and gluconeogenic enzymes in HepG2 cells with AMPKα1/α2 silencing
如图6A所示，与空白组和阴性空质粒组比较，AMPK的表达在干扰质粒为20、40 pmol/孔时均被极显著抑制（P＜0.01），当干扰质粒的浓度为40 pmol/孔时，AMPK表达被抑制了78%。此时，相对于空白组和阴性空质粒组，基因敲除AMPK的HepG2肝细胞中p-辛弗林对肝细胞葡萄糖生成、G6Pase和PEPCK活力无显著性影响（P＞0.05）（图6B～D）。
本研究结果表明，p-辛弗林能够抑制肝细胞葡萄糖的生成，这种抑制作用可能是通过激活AMPK-FoxO1信号通路从而抑制葡萄糖异生相关酶活力而实现的。
肝脏糖异生是肝糖代谢的重要组成部分，对维持细胞或者机体中糖的稳态起重要作用[19-20]。研究表明，p-辛弗林能够增加肝细胞内cAMP含量，促进葡萄糖的呼吸作用[8-9]，但是p-辛弗林对肝细胞糖异生的影响及其中的作用机制还不清楚。本研究首先在人肝癌HepG2细胞上检测了p-辛弗林对葡萄糖生成的作用，结果证实p-辛弗林能够部分抑制肝细胞葡萄糖生成，这种抑制作用经由AMPK信号通路。
AMPK作为一种“能量感受器”，在肝脏等组织中广泛表达，其在调节机体能量代谢平衡方面发挥至关重要的作用[21]。AMPK能够调节葡萄糖和脂类代谢，降低外周胰岛素抵抗[22]。本研究发现，p-辛弗林显著增加AMPK及其直接下游底物ACC的磷酸化表达水平，这个结果提示AMPK信号通路有可能参与了p-辛弗林对肝细胞葡萄糖生成的抑制作用。通过AMPK特异性的抑制剂Compound C和AMPK siRNA证实了这个假设，p-辛弗林减少肝细胞葡萄糖生成的作用被Compound C和AMPK siRNA部分抑制。
有研究表明，激活AMPK可以抑制肝糖异生的G6Pase和PEPCK两个关键酶的活力，抑制肝糖异生，减少葡萄糖生成[23-24]。本研究中，p-辛弗林抑制了HepG2细胞中G6Pase和PEPCK活力，而且Compound C和AMPK siRNA抑制了p-辛弗林降低酶活力的作用。因此，AMPK在p-辛弗林调节肝糖异生关键酶活力中起重要作用。
转录因子FoxO1与AMPK信号通路调节的肝糖代谢有密切关系[25-26]。在肝脏中，活化的FoxO1（磷酸化后失去转录活性）通过与G6Pase和PEPCK的基因启动子结合而激活G6Pase和PEPCK的转录，进一步促进葡萄糖生成[27-30]。本研究结果显示，p-辛弗林呈剂量依赖性磷酸化FoxO1，这些结果阐明了p-辛弗林抑制酶活力的分子作用机制。
综上所述，p-辛弗林可通过激活AMPK信号通路，使FoxO1磷酸化而失去转录活性，从而抑制G6Pase和PEPCK活力，改善肝细胞糖异生，减少肝细胞葡萄糖相对生成量。激活AMPK信号通路可能是p-辛弗林调节肝细胞糖异生的机制之一。
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