食品乳化液是一种热力学不稳定体系[1-2],容易出现失稳现象,乳化液失稳后会发生脂肪颗粒上浮、油水两相分离以及底部出现沉淀等现象,严重影响到产品的货架期和感官品质[3]。
有研究表明,蛋白质是一种大分子表面活性剂,能够在脂肪颗粒表面上吸附并定向排列形成界面吸附层,降低脂肪球界面张力,防止脂肪颗粒间的聚结,提高分散体系的稳定性[4]。但是蛋白质稳定的乳化液对pH值、温度和离子强度等环境条件十分敏感,尤其在蛋白质等电点附近、高温处理或较高离子强度下,乳状液易发生粒径增大、乳状液分层等脱稳现象,限制了其在食品加工过程中的应用[4-5]。
前期研究发现不同多糖、变性淀粉及改性纤维素可以提高乳化液的黏稠度,吸附于液滴表面增加界面膜的厚度,在乳化液中形成凝胶结构提供空间屏障,改变食品体系的物理特性,降低液滴的运动速率,提高乳化液的稳定性[6-8]。微晶纤维素(microcrystalline cellulose,MCC)是一种水不溶性纤维素,由于分子间氢键作用力强而导致其表面活性差,只能通过吸水溶胀稳定乳化液[9-10]。由MCC通过磷酸溶解和水再生得到的凝胶态再生纤维素(regenerated cellulose,RC)具有较高的表面活性,具有疏水和亲水基,因此具有很强的增稠能力[11]。将纤维素多糖与蛋白质组合,可以通过增加脂肪球周围的吸附层的厚度以及形成一定的空间位阻,改善乳液体系的稳定[3,12]。
乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)营养性良好,且具有乳化特性、起泡特性和凝胶特性,在食品加工中常被用作乳化剂或发泡剂等[13]。由WPI稳定的橄榄油乳化液粒径小,营养价值好,可被用作脂肪替代物生产低脂肉制品[14]。但由于WPI容易受到加工环境条件的影响,如pH值、温度、离子强度等,使橄榄油乳化液发生粒径增大,乳化液分层等脱稳现象。
本研究旨在向WPI-橄榄油预乳化液中添加不同比例RC凝胶,通过测定乳化液表观稳定性、分层指数、乳滴粒径大小、乳化液流变特性以及观察微观结构的变化情况,研究RC凝胶对WPI-橄榄油预乳化液稳定性的影响,为提高蛋白质乳化液稳定性提供理论参考。
欧丽薇兰橄榄油 市购;MCC 山东曲阜天利药用辅料有限公司;牛乳WPI(含蛋白质90%) 河南正兴食品有限公司;85%磷酸(食品级) 江苏澄星磷化工有限公司。
LSHZ-300型冷冻水浴恒温振器 常州诺基仪器有限公司;Beckman Avanti J-E离心机 美国Beckman Coulter公司;Ultra Turrax T-25 Basic高速匀浆机、C-MAG HS7磁力搅拌器 德国IKA公司;FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司;Masterizer 3000激光粒度分析仪 英国马尔文仪器有限公司;MCR301旋转流变仪奥地利安东帕(中国)有限公司;奥林巴斯FV3000激光共聚焦显微镜 南京奥力科学仪器有限公司。
1.3.1 RC的制备
参照Jia Xuejuan等[15]的方法并稍作修改。取4 g MCC,用12 g去离子水润湿、摇匀,加入160 mL 4 ℃预冷的85%食品级磷酸,获得乳白色悬浮液;置于4 ℃振荡器中以150 r/min转速孵育24 h,获得澄清、透明的纤维素胶体溶液;取出后加入800 mL去离子水混匀静置2 h,然后16 500×g离心15 min,重复水洗离心至上清液pH值恒定在6.0~6.5之间,获得半固体凝胶态的RC,采用烘箱称重法测定RC最终质量分数为4.50%。
1.3.2 RC乳化液的制备
将2 g WPI充分溶解在20 mL去离子水中,然后加入橄榄油,12 000 r/min高速匀浆1.5 min获得预乳化液;将RC和相应的去离子水加入预乳化液,继续12 000 r/min匀浆1.5 min,最终得到RC乳化液。乳化液中橄榄油质量分数为30%,WPI的质量分数为2.0%,RC添加量分别为0%、0.4%、0.8%、1.2%和1.6%。为了避免匀浆过程中产热使蛋白质变性,整个匀浆过程在冰浴中进行。
1.3.3 乳化液稳定性
将制备好的乳化液分别取12 mL于透明玻璃瓶中,室温条件下静置1 周,观察记录乳化液每天的分层情况,并拍照保存;乳化液分层指数是指乳化液在贮存期间下层(乳清层)的高度占乳化液总高度的比值,按公式(1)计算:
式中:Hs为实测下层清液高度/cm;Ht为乳化液的总高度/cm。
1.3.4 乳化活性
参考Diao Xiaoqin等[16]的方法并稍作修改。取50 μL乳化液,加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液混匀,在波长500 nm处测定样品吸光度,记为A0;在乳化液制备完成的30 min和60 min时重复之前操作,测定吸光度为A30和A60。乳化活性按公式(2)计算:
式中:A为乳化液分别在0、30 min和60 min时的吸光度;C为乳化液中WPI质量浓度/(g/mL);φ为乳化液中橄榄油的体积分数/%;N为稀释倍数(100)。
1.3.5 粒度大小及分布
乳化液中油滴的粒度大小及分布通过Mastersizer 3000激光粒度分析仪测定,粒度大小以体积质量等效平均直径(D4,3)表示。测定参数为:湿法进样,颗粒折射率为1.476,吸收率为0.001;分散剂为水,折射率为1.330。测试前将乳化液分别用等体积的水和1.0% SDS稀释[17],可以通过两者粒度大小的变化,按公式(3)计算乳化液滴的絮凝程度。
式中:D4,3-SDS为不加SDS时测定的乳化液滴直径/μm;D4,3+SDS为加SDS时测定的乳化液滴直径/μm。
1.3.6 流变特性
乳化液的流变特性通过MCR301旋转流变仪测定,测定时温度设定为25 ℃,转子型号选择PP50,间隙设置为0.5 mm。表观黏度在0.01~101 s-1剪切速率范围内测定,得到黏度随剪切速率变化的曲线;动态振荡扫描(储能模量G′、损耗模量G′)在应变为0.1%,频率为0.1~100 Hz范围内测定,得到G′、G”随频率变化的曲线。
1.3.7 微观结构
乳化液微观结构通过激光共聚焦显微镜观察,向5 mL乳化液中分别加入200 μL尼罗红(0.01%)和200 μL尼罗蓝(0.01%),充分混匀后置于摇床过夜染色。取微量染色乳化液,在488 nm(尼罗红)和633 nm(尼罗蓝)波长,置于60 倍目镜下观察乳滴的微观结构及分布情况。
所有实验均重复3 次,结果以表示,所得数据用统计软件SAS 8.1进行方差分析,采用单因素ANOVA分析(P<0.05),并通过Duncan's法进行数据的显著性分析。当P<0.05,差异显著。
2.1.1 表观稳定性
如图1所示,乳化液制备后的初期在表观上没有显著差异(图1A),放置过程中,未添加RC的乳化液最先开始出现分层现象。放置7 d后,由图1B可知,未添加RC的乳化液分层最为严重,在下层出现蛋白聚集物,且随着放置时间的延长,乳化液的分层界面越来越明显,乳化液体系是一种絮凝物与非絮凝物共存状态[18]。随着RC添加量的增加,分层现象得到了有效抑制,当添加0.8%及以上的RC时不再发生乳析分层,主要原因可能是RC凝胶的增稠能力增强,乳化液黏度增大。
图1 RC添加量对乳化液表观稳定性的影响
Fig. 1 Effect of RC concentration on the visual appearance of emulsion
2.1.2 分层稳定性
图2 RC添加量对乳化液分层指数的影响
Fig. 2 Effect of RC concentration on the creaming index of emulsion
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由图2可知,添加0%和0.4% RC的乳化液均在第1天开始出现分层现象,分层指数分别为56.82%和27.27%,添加0.8%、1.2%和1.6% RC处理组的乳化液在存放时间内都没有发生分层。这是由于当连续相中含有0.4% RC时,不能产生足够高的黏度而形成弱凝胶,导致乳化液滴之间聚结,絮凝程度高,形成较大颗粒,所以分层较快。乳化液的分层稳定性随RC添加量的增加而增强,主要原因可能是随着RC添加量的增加,增加了连续相黏度,同时由于RC在乳化液中的空间位阻作用,使液滴粒度减小,液滴与连续相之间的密度差减小,分层稳定性提高。
表1 RC添加量对乳化液粒度大小及絮凝程度的影响
Table 1 Effect of RC concentration on the particle size and fl occulation degree of emulsion
注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。表2同。
RC添加量/%D4,3-SDS/μmD4,3+SDS/μm 絮凝程度/%0 23.08±1.08a 20.86±0.96a 10.64±0.58a 0.4 20.86±0.87b 18.98±0.79b 9.91±0.78a 0.8 18.76±1.26c 17.20±1.13c 9.06±0.79b 1.2 15.12±1.15e 14.12±1.08e 7.09±0.10d 1.6 17.04±1.63d 15.74±1.45d 8.23±0.55c
图3 RC添加量对乳化液粒度分布的影响
Fig. 3 Effect of RC concentration on the particle size distribution of emulsion
如表1所示,在不添加SDS的情况下,随着RC添加量的增加,乳化液液滴D4,3先减小后增大,添加1.2% RC时乳化液液滴大小显著小于其他RC添加量处理组(P<0.05)。如图3所示,乳化液颗粒直径的分布随着RC添加量的增大整体趋势向左偏移,且当RC添加量增加到1.2%时第3个峰消失,第2个峰高增加,即大粒径的液滴减少,小粒径液滴增加,表明粒度大小更加均匀。
在测定粒径大小的过程中加入SDS是为了使WPI发生变性,导致吸附在乳滴表面的蛋白减少,引起乳化液发生絮凝现象[19],利于研究RC对乳化液絮凝变化的影响。添加SDS与不添加SDS所测得的乳化液D4,3趋势相同,但添加SDS的乳化液颗粒略小于不加SDS处理组,这是由于SDS使蛋白变性,吸附在表面的蛋白减少。不添加RC或添加量较低(0.4%)时乳化液的絮凝程度高,随着RC添加量增加到1.2%时,乳化液絮凝程度显著降低(P<0.05),当RC添加量达到1.6%时,絮凝程度增加,说明RC只有在适当添加量条件下才可以抑制乳化液发生絮凝现象。
虽然RC是水不溶性多糖,但是可以通过氢键、疏水力与蛋白质相互作用,使其在乳化液体系中具有良好的分散性[20-21]。连续相中随着RC添加量增加,乳化液黏度增大,为乳化液滴提供了良好的空间屏障,减缓了乳化液滴移动的速率,使乳化液之间聚结,絮凝程度降低,粒径随之减小[22]。但是当凝胶态RC添加量达到1.6%时,D4,3略有增加,可能是因为在连续相中RC添加量过多,导致液滴与液滴间隙过小,阻碍了均质过程中WPI在连续相中的移动以及在油滴表面的吸附作用[23],或者把已经吸附在乳滴表面的蛋白排挤出来,进而使乳化液出现耗损絮凝,聚结在一起形成较大的颗粒[4]。Liu Liya等[24]研究结果与本实验相似,乳化液中过量的羧甲基纤维素诱导乳化液发生耗损絮凝。分层现象与粒度大小、絮凝情况密切相关,当RC添加量达到1.6%时,虽然颗粒增大,絮凝程度升高,但由于其黏度过大,阻止了分层现象的发生(图1)。
如图4可知,没有添加RC或添加量较低(0.4%)的乳化液油滴较大;RC添加量为0.8%时乳化液滴显著减小,但油滴大小均一性不好;添加1.2% RC稳定的乳化液粒径最小,且分布均匀,分散性好;RC添加量为1.6%时,油滴略有增大,并且出现乳滴聚集成团现象。乳化液微观结构图与乳化液粒度大小(表1)的结果相一致。随着RC添加量的增加,连续相中RC结构的增强,乳化液中RC添加量为1.2%时,表现出很强的增稠能力,同时RC可能在乳化液中形成网状结构[15],从而削弱了液滴与液滴间的聚集作用,使乳化液滴可以均匀地分散在连续相中,且保持较小的粒径。有研究表明,山竹微纤化纤维素由于其较大的纵横比,形成较强的相互作用和无序的网络结构,阻碍了乳化液发生絮凝从而达到稳定乳化液的目的[25]。本研究中的RC具有与山竹微纤化纤维素类似的形态和凝胶特性。
图4 RC添加量对乳化液微观结构的影响
Fig. 4 Effect of RC concentration on the CLSM micrograph of emulsion
A~E. RC添加量分别为0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%。
表2 RC添加量对乳化液乳化活性的影响
Table 2 Effect of RC concentration on the EAI of emulsion
RC添加量/% 乳化活性/(m2/g)0 min 30 min 60 min 0 4.25±0.22b 3.09±0.04e 1.46±0.01e 0.4 4.40±0.07b 4.09±0.07d 3.20±0.02d 0.8 4.66±0.07a 4.38±0.03c 3.99±0.04c 1.2 4.86±0.09a 4.77±0.04a 4.55±0.12a 1.6 4.69±0.06a 4.57±0.05b 4.31±0.10b
如表2所示,在0 min条件下,从整体上看,乳化活性随着RC添加量的增加呈增加趋势,但是当添加量增加到0.8%及以上时差异不显著,在30 min和60 min后,乳化液中添加了RC的乳化活性显著高于没有添加RC处理组(P<0.05),尤其在60 min条件下,没有添加RC的乳化活性仅为1.46 m2/g,而添加1.2% RC的乳化活性提高到4.55 m2/g。这证明RC在WPI乳化液中起到了良好的乳化作用,可以被认为是乳化稳定剂。这与乳化液粒度大小与分层稳定性的结果具有一致性,乳化活性越高,乳化液滴越小,导致乳化液稳定性越好。
2.5.1 表观黏度
图5 RC添加量对乳化液表观黏度的影响
Fig. 5 Effect of RC concentration on the apparent viscosity of emulsion
如图5所示,乳化液的表观黏度随剪切速率增加而降低,呈现出剪切稀化行为,属于非牛顿假塑性流体[26]。乳化液黏度的变化主要是由于乳化液滴聚集状态的变化,在剪切过程中乳化液液滴的絮凝结构遭到破坏[27]。没有添加RC的乳化液表观黏度最低,随着RC添加量的增加,乳化液黏度逐渐增大。这是因为随着RC添加量的增加,结合水的能力增强,增稠能力提高,体系的零剪切黏度增加,随着剪切速率的增加,乳化液的内部结构被破坏,分子按照剪切速率的方向线性排列,样品的黏度和剪切应力逐渐减小[28]。这与Hu Hongyan等[10]的研究结果具有一致性,可能是因为RC形成特定的空间网络结构,而增大乳化液的黏度,高黏度可以抑制液滴的移动,防止其聚结和分层现象的发生,从而获得更好的乳液稳定性。这些结果与乳化液的粒度大小和分层稳定性的结果相一致。
2.5.2 动态振荡扫描特性
图6 RC添加量对乳化液频率扫描的影响
Fig. 6 Effect of RC concentration on the frequency sweep of emulsion
动态振荡实验是研究乳化液黏弹性的重要方法,可以通过模量的大小显示乳化液体系结构的强弱[29]。在应变保持1.0%不变,乳化液处于线性黏弹区,进行乳化液的G′和G”的测定,结果如图6所示。不同乳化液的G′和G”随着振荡频率的增加稍有增加趋势,但随着RC添加量的增加,G′和G”对频率变化的依赖性降低,变化幅度减小,变化曲线趋于平稳,并且在线性黏弹性范围内G′大于G”,表明乳化液属于一种典型的弹性凝胶体系[1,30],而且说明液滴间相互作用增强,乳化液内形成了稳定结构[7,31],这种稳定的结构可能归因于RC在流动相中形成凝胶状网络结构。
本实验研究不同添加量的RC对WPI-橄榄油预乳化液稳定性的影响,MCC通过磷酸溶解、水再生得到的RC结晶区部分被破坏[15],RC可以通过氢键和疏水作用在乳化液体系中有良好的分散性,而且凝胶态的RC相比与粉末状的MCC具有更强的增稠能力[32]。随着RC添加量的增加,乳化液的黏度增强,结构更加稳定。其中RC添加量为1.2%时,乳化液的粒径最小,絮凝程度最低,稳定性最好。RC能够稳定WPI乳化液的原因可能是RC凝胶的增稠作用,以及在乳化液中形成网络结构,延缓液滴的移动,形成空间屏障防止液滴间的絮凝与聚结,从而起到稳定WPI-乳化液的作用。在30%橄榄油和2.0%的WPI预乳化液中,添加1.2% RC可以有效改善蛋白质预乳化液的乳化稳定性。
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