再生纤维素凝胶对乳清分离蛋白预乳化液稳定性的影响

赵尹毓,田筱娜,周光宏,张万刚*

(南京农业大学食品科技学院,江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,肉品加工与质量控制教育部重点实验室,江苏 南京 210095)

摘 要: 利用再生纤维素(regenerated cellulose,RC)凝胶改善蛋白质预乳化液的乳化稳定性。考察添加量分别为0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的RC对乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)-橄榄油预乳化液乳化稳定性、乳化活性、粒度大小、微观结构、流变特性的影响。结果表明,添加RC可以显著提高WPI预乳化液的乳化稳定性及乳化活性(P<0.05),RC添加量为0.8%时可以有效抑制乳化液的分层现象;随着RC添加量的增加,乳化液粒度大小及絮凝程度显著降低(P<0.05);乳化液流变学特性显示RC具有很好的增稠作用和凝胶性能。结果表明RC的添加对于WPI-预乳化液稳定性有很大影响,预乳化液中添加1.2% RC,可以有效增加乳化液黏度,获得较强的凝胶网络结构,显著降低粒度,改善乳化液稳定性。

关键词: 再生纤维素;乳清分离蛋白;乳化液稳定性;粒度大小;黏度

食品乳化液是一种热力学不稳定体系[1-2],容易出现失稳现象,乳化液失稳后会发生脂肪颗粒上浮、油水两相分离以及底部出现沉淀等现象,严重影响到产品的货架期和感官品质[3]

有研究表明,蛋白质是一种大分子表面活性剂,能够在脂肪颗粒表面上吸附并定向排列形成界面吸附层,降低脂肪球界面张力,防止脂肪颗粒间的聚结,提高分散体系的稳定性[4]。但是蛋白质稳定的乳化液对pH值、温度和离子强度等环境条件十分敏感,尤其在蛋白质等电点附近、高温处理或较高离子强度下,乳状液易发生粒径增大、乳状液分层等脱稳现象,限制了其在食品加工过程中的应用[4-5]

前期研究发现不同多糖、变性淀粉及改性纤维素可以提高乳化液的黏稠度,吸附于液滴表面增加界面膜的厚度,在乳化液中形成凝胶结构提供空间屏障,改变食品体系的物理特性,降低液滴的运动速率,提高乳化液的稳定性[6-8]。微晶纤维素(microcrystalline cellulose,MCC)是一种水不溶性纤维素,由于分子间氢键作用力强而导致其表面活性差,只能通过吸水溶胀稳定乳化液[9-10]。由MCC通过磷酸溶解和水再生得到的凝胶态再生纤维素(regenerated cellulose,RC)具有较高的表面活性,具有疏水和亲水基,因此具有很强的增稠能力[11]。将纤维素多糖与蛋白质组合,可以通过增加脂肪球周围的吸附层的厚度以及形成一定的空间位阻,改善乳液体系的稳定[3,12]

乳清分离蛋白(whey protein isolate,WPI)营养性良好,且具有乳化特性、起泡特性和凝胶特性,在食品加工中常被用作乳化剂或发泡剂等[13]。由WPI稳定的橄榄油乳化液粒径小,营养价值好,可被用作脂肪替代物生产低脂肉制品[14]。但由于WPI容易受到加工环境条件的影响,如pH值、温度、离子强度等,使橄榄油乳化液发生粒径增大,乳化液分层等脱稳现象。

本研究旨在向WPI-橄榄油预乳化液中添加不同比例RC凝胶,通过测定乳化液表观稳定性、分层指数、乳滴粒径大小、乳化液流变特性以及观察微观结构的变化情况,研究RC凝胶对WPI-橄榄油预乳化液稳定性的影响,为提高蛋白质乳化液稳定性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

欧丽薇兰橄榄油 市购;MCC 山东曲阜天利药用辅料有限公司;牛乳WPI(含蛋白质90%) 河南正兴食品有限公司;85%磷酸(食品级) 江苏澄星磷化工有限公司。

1.2 仪器与设备

LSHZ-300型冷冻水浴恒温振器 常州诺基仪器有限公司;Beckman Avanti J-E离心机 美国Beckman Coulter公司;Ultra Turrax T-25 Basic高速匀浆机、C-MAG HS7磁力搅拌器 德国IKA公司;FE20 pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司;DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司;Masterizer 3000激光粒度分析仪 英国马尔文仪器有限公司;MCR301旋转流变仪奥地利安东帕(中国)有限公司;奥林巴斯FV3000激光共聚焦显微镜 南京奥力科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RC的制备

参照Jia Xuejuan等[15]的方法并稍作修改。取4 g MCC,用12 g去离子水润湿、摇匀,加入160 mL 4 ℃预冷的85%食品级磷酸,获得乳白色悬浮液;置于4 ℃振荡器中以150 r/min转速孵育24 h,获得澄清、透明的纤维素胶体溶液;取出后加入800 mL去离子水混匀静置2 h,然后16 500×g离心15 min,重复水洗离心至上清液pH值恒定在6.0~6.5之间,获得半固体凝胶态的RC,采用烘箱称重法测定RC最终质量分数为4.50%。

1.3.2 RC乳化液的制备

将2 g WPI充分溶解在20 mL去离子水中,然后加入橄榄油,12 000 r/min高速匀浆1.5 min获得预乳化液;将RC和相应的去离子水加入预乳化液,继续12 000 r/min匀浆1.5 min,最终得到RC乳化液。乳化液中橄榄油质量分数为30%,WPI的质量分数为2.0%,RC添加量分别为0%、0.4%、0.8%、1.2%和1.6%。为了避免匀浆过程中产热使蛋白质变性,整个匀浆过程在冰浴中进行。

1.3.3 乳化液稳定性

将制备好的乳化液分别取12 mL于透明玻璃瓶中,室温条件下静置1 周,观察记录乳化液每天的分层情况,并拍照保存;乳化液分层指数是指乳化液在贮存期间下层(乳清层)的高度占乳化液总高度的比值,按公式(1)计算:

式中:Hs为实测下层清液高度/cm;Ht为乳化液的总高度/cm。

1.3.4 乳化活性

参考Diao Xiaoqin等[16]的方法并稍作修改。取50 μL乳化液,加入5 mL 0.1%十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液混匀,在波长500 nm处测定样品吸光度,记为A0;在乳化液制备完成的30 min和60 min时重复之前操作,测定吸光度为A30和A60。乳化活性按公式(2)计算:

式中:A为乳化液分别在0、30 min和60 min时的吸光度;C为乳化液中WPI质量浓度/(g/mL);φ为乳化液中橄榄油的体积分数/%;N为稀释倍数(100)。

1.3.5 粒度大小及分布

乳化液中油滴的粒度大小及分布通过Mastersizer 3000激光粒度分析仪测定,粒度大小以体积质量等效平均直径(D4,3)表示。测定参数为:湿法进样,颗粒折射率为1.476,吸收率为0.001;分散剂为水,折射率为1.330。测试前将乳化液分别用等体积的水和1.0% SDS稀释[17],可以通过两者粒度大小的变化,按公式(3)计算乳化液滴的絮凝程度。

式中:D4,3-SDS为不加SDS时测定的乳化液滴直径/μm;D4,3+SDS为加SDS时测定的乳化液滴直径/μm。

1.3.6 流变特性

乳化液的流变特性通过MCR301旋转流变仪测定,测定时温度设定为25 ℃,转子型号选择PP50,间隙设置为0.5 mm。表观黏度在0.01~101 s-1剪切速率范围内测定,得到黏度随剪切速率变化的曲线;动态振荡扫描(储能模量G′、损耗模量G′)在应变为0.1%,频率为0.1~100 Hz范围内测定,得到G′、G”随频率变化的曲线。

1.3.7 微观结构

乳化液微观结构通过激光共聚焦显微镜观察,向5 mL乳化液中分别加入200 μL尼罗红(0.01%)和200 μL尼罗蓝(0.01%),充分混匀后置于摇床过夜染色。取微量染色乳化液,在488 nm(尼罗红)和633 nm(尼罗蓝)波长,置于60 倍目镜下观察乳滴的微观结构及分布情况。

1.4 数据统计分析

所有实验均重复3 次,结果以表示,所得数据用统计软件SAS 8.1进行方差分析,采用单因素ANOVA分析(P<0.05),并通过Duncan's法进行数据的显著性分析。当P<0.05,差异显著。

2 结果与分析

2.1 乳化液稳定性结果

2.1.1 表观稳定性

如图1所示,乳化液制备后的初期在表观上没有显著差异(图1A),放置过程中,未添加RC的乳化液最先开始出现分层现象。放置7 d后,由图1B可知,未添加RC的乳化液分层最为严重,在下层出现蛋白聚集物,且随着放置时间的延长,乳化液的分层界面越来越明显,乳化液体系是一种絮凝物与非絮凝物共存状态[18]。随着RC添加量的增加,分层现象得到了有效抑制,当添加0.8%及以上的RC时不再发生乳析分层,主要原因可能是RC凝胶的增稠能力增强,乳化液黏度增大。

图1 RC添加量对乳化液表观稳定性的影响
Fig. 1 Effect of RC concentration on the visual appearance of emulsion

2.1.2 分层稳定性

图2 RC添加量对乳化液分层指数的影响
Fig. 2 Effect of RC concentration on the creaming index of emulsion

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

由图2可知,添加0%和0.4% RC的乳化液均在第1天开始出现分层现象,分层指数分别为56.82%和27.27%,添加0.8%、1.2%和1.6% RC处理组的乳化液在存放时间内都没有发生分层。这是由于当连续相中含有0.4% RC时,不能产生足够高的黏度而形成弱凝胶,导致乳化液滴之间聚结,絮凝程度高,形成较大颗粒,所以分层较快。乳化液的分层稳定性随RC添加量的增加而增强,主要原因可能是随着RC添加量的增加,增加了连续相黏度,同时由于RC在乳化液中的空间位阻作用,使液滴粒度减小,液滴与连续相之间的密度差减小,分层稳定性提高。

2.2 乳化液粒度大小及分布

表1 RC添加量对乳化液粒度大小及絮凝程度的影响
Table 1 Effect of RC concentration on the particle size and fl occulation degree of emulsion

注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。表2同。

RC添加量/%D4,3-SDS/μmD4,3+SDS/μm 絮凝程度/%0 23.08±1.08a 20.86±0.96a 10.64±0.58a 0.4 20.86±0.87b 18.98±0.79b 9.91±0.78a 0.8 18.76±1.26c 17.20±1.13c 9.06±0.79b 1.2 15.12±1.15e 14.12±1.08e 7.09±0.10d 1.6 17.04±1.63d 15.74±1.45d 8.23±0.55c

图3 RC添加量对乳化液粒度分布的影响
Fig. 3 Effect of RC concentration on the particle size distribution of emulsion

如表1所示,在不添加SDS的情况下,随着RC添加量的增加,乳化液液滴D4,3先减小后增大,添加1.2% RC时乳化液液滴大小显著小于其他RC添加量处理组(P<0.05)。如图3所示,乳化液颗粒直径的分布随着RC添加量的增大整体趋势向左偏移,且当RC添加量增加到1.2%时第3个峰消失,第2个峰高增加,即大粒径的液滴减少,小粒径液滴增加,表明粒度大小更加均匀。

在测定粒径大小的过程中加入SDS是为了使WPI发生变性,导致吸附在乳滴表面的蛋白减少,引起乳化液发生絮凝现象[19],利于研究RC对乳化液絮凝变化的影响。添加SDS与不添加SDS所测得的乳化液D4,3趋势相同,但添加SDS的乳化液颗粒略小于不加SDS处理组,这是由于SDS使蛋白变性,吸附在表面的蛋白减少。不添加RC或添加量较低(0.4%)时乳化液的絮凝程度高,随着RC添加量增加到1.2%时,乳化液絮凝程度显著降低(P<0.05),当RC添加量达到1.6%时,絮凝程度增加,说明RC只有在适当添加量条件下才可以抑制乳化液发生絮凝现象。

虽然RC是水不溶性多糖,但是可以通过氢键、疏水力与蛋白质相互作用,使其在乳化液体系中具有良好的分散性[20-21]。连续相中随着RC添加量增加,乳化液黏度增大,为乳化液滴提供了良好的空间屏障,减缓了乳化液滴移动的速率,使乳化液之间聚结,絮凝程度降低,粒径随之减小[22]。但是当凝胶态RC添加量达到1.6%时,D4,3略有增加,可能是因为在连续相中RC添加量过多,导致液滴与液滴间隙过小,阻碍了均质过程中WPI在连续相中的移动以及在油滴表面的吸附作用[23],或者把已经吸附在乳滴表面的蛋白排挤出来,进而使乳化液出现耗损絮凝,聚结在一起形成较大的颗粒[4]。Liu Liya等[24]研究结果与本实验相似,乳化液中过量的羧甲基纤维素诱导乳化液发生耗损絮凝。分层现象与粒度大小、絮凝情况密切相关,当RC添加量达到1.6%时,虽然颗粒增大,絮凝程度升高,但由于其黏度过大,阻止了分层现象的发生(图1)。

2.3 乳化液微观结构

如图4可知,没有添加RC或添加量较低(0.4%)的乳化液油滴较大;RC添加量为0.8%时乳化液滴显著减小,但油滴大小均一性不好;添加1.2% RC稳定的乳化液粒径最小,且分布均匀,分散性好;RC添加量为1.6%时,油滴略有增大,并且出现乳滴聚集成团现象。乳化液微观结构图与乳化液粒度大小(表1)的结果相一致。随着RC添加量的增加,连续相中RC结构的增强,乳化液中RC添加量为1.2%时,表现出很强的增稠能力,同时RC可能在乳化液中形成网状结构[15],从而削弱了液滴与液滴间的聚集作用,使乳化液滴可以均匀地分散在连续相中,且保持较小的粒径。有研究表明,山竹微纤化纤维素由于其较大的纵横比,形成较强的相互作用和无序的网络结构,阻碍了乳化液发生絮凝从而达到稳定乳化液的目的[25]。本研究中的RC具有与山竹微纤化纤维素类似的形态和凝胶特性。

图4 RC添加量对乳化液微观结构的影响
Fig. 4 Effect of RC concentration on the CLSM micrograph of emulsion

A~E. RC添加量分别为0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%。

2.4 乳化活性

表2 RC添加量对乳化液乳化活性的影响
Table 2 Effect of RC concentration on the EAI of emulsion

RC添加量/% 乳化活性/(m2/g)0 min 30 min 60 min 0 4.25±0.22b 3.09±0.04e 1.46±0.01e 0.4 4.40±0.07b 4.09±0.07d 3.20±0.02d 0.8 4.66±0.07a 4.38±0.03c 3.99±0.04c 1.2 4.86±0.09a 4.77±0.04a 4.55±0.12a 1.6 4.69±0.06a 4.57±0.05b 4.31±0.10b

如表2所示,在0 min条件下,从整体上看,乳化活性随着RC添加量的增加呈增加趋势,但是当添加量增加到0.8%及以上时差异不显著,在30 min和60 min后,乳化液中添加了RC的乳化活性显著高于没有添加RC处理组(P<0.05),尤其在60 min条件下,没有添加RC的乳化活性仅为1.46 m2/g,而添加1.2% RC的乳化活性提高到4.55 m2/g。这证明RC在WPI乳化液中起到了良好的乳化作用,可以被认为是乳化稳定剂。这与乳化液粒度大小与分层稳定性的结果具有一致性,乳化活性越高,乳化液滴越小,导致乳化液稳定性越好。

2.5 乳化液流变特性

2.5.1 表观黏度

图5 RC添加量对乳化液表观黏度的影响
Fig. 5 Effect of RC concentration on the apparent viscosity of emulsion

如图5所示,乳化液的表观黏度随剪切速率增加而降低,呈现出剪切稀化行为,属于非牛顿假塑性流体[26]。乳化液黏度的变化主要是由于乳化液滴聚集状态的变化,在剪切过程中乳化液液滴的絮凝结构遭到破坏[27]。没有添加RC的乳化液表观黏度最低,随着RC添加量的增加,乳化液黏度逐渐增大。这是因为随着RC添加量的增加,结合水的能力增强,增稠能力提高,体系的零剪切黏度增加,随着剪切速率的增加,乳化液的内部结构被破坏,分子按照剪切速率的方向线性排列,样品的黏度和剪切应力逐渐减小[28]。这与Hu Hongyan等[10]的研究结果具有一致性,可能是因为RC形成特定的空间网络结构,而增大乳化液的黏度,高黏度可以抑制液滴的移动,防止其聚结和分层现象的发生,从而获得更好的乳液稳定性。这些结果与乳化液的粒度大小和分层稳定性的结果相一致。

2.5.2 动态振荡扫描特性

图6 RC添加量对乳化液频率扫描的影响
Fig. 6 Effect of RC concentration on the frequency sweep of emulsion

动态振荡实验是研究乳化液黏弹性的重要方法,可以通过模量的大小显示乳化液体系结构的强弱[29]。在应变保持1.0%不变,乳化液处于线性黏弹区,进行乳化液的G′和G”的测定,结果如图6所示。不同乳化液的G′和G”随着振荡频率的增加稍有增加趋势,但随着RC添加量的增加,G′和G”对频率变化的依赖性降低,变化幅度减小,变化曲线趋于平稳,并且在线性黏弹性范围内G′大于G”,表明乳化液属于一种典型的弹性凝胶体系[1,30],而且说明液滴间相互作用增强,乳化液内形成了稳定结构[7,31],这种稳定的结构可能归因于RC在流动相中形成凝胶状网络结构。

3 结 论

本实验研究不同添加量的RC对WPI-橄榄油预乳化液稳定性的影响,MCC通过磷酸溶解、水再生得到的RC结晶区部分被破坏[15],RC可以通过氢键和疏水作用在乳化液体系中有良好的分散性,而且凝胶态的RC相比与粉末状的MCC具有更强的增稠能力[32]。随着RC添加量的增加,乳化液的黏度增强,结构更加稳定。其中RC添加量为1.2%时,乳化液的粒径最小,絮凝程度最低,稳定性最好。RC能够稳定WPI乳化液的原因可能是RC凝胶的增稠作用,以及在乳化液中形成网络结构,延缓液滴的移动,形成空间屏障防止液滴间的絮凝与聚结,从而起到稳定WPI-乳化液的作用。在30%橄榄油和2.0%的WPI预乳化液中,添加1.2% RC可以有效改善蛋白质预乳化液的乳化稳定性。

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Effect of Regenerated Cellulose Gel on the Stability of Pre-Emulsion with Whey Protein Isolate

ZHAO Yinyu, TIAN Xiaona, ZHOU Guanghong, ZHANG Wangang*
(Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education,Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control,College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Abstract: The objective of this study was to improve the stability of oil-in-water (O/W) pre-emulsion stabilized by whey protein isolate (WPI) using regenerated cellulose (RC) gel. Emulsions were prepared by adding 0%, 0.4%, 0.8%, 1.2% and 1.6% RC, respectively. The stability was examined by measuring stability index, emulsifying activity index (EAI), droplet size, microstructure and rheological properties. The results illustrated that emulsion stability and EAI were significantly improved by RC (P < 0.05) and creaming was effectively inhibited by the addition of 0.8% RC. With the increase of RC, the droplet size and fl occulation of emulsions showed a decreasing trend (P < 0.05). The rheological properties showed that RC had a great inf l uence on the stability of WPI-stabilized emulsions. Addition of 1.2% RC enhanced the apparent viscosity of emulsions, resulted in the formation of a strong gel network structure, significantly reduced the droplet size and improved the stability.

Keywords: regenerated cellulose; whey protein isolate; emulsion stability; droplet size; viscosity

收稿日期:2018-01-09

基金项目:“十三五”国家重点研发计划重点专项(2016YFD0400703);国家生猪产业技术体系项目(CARS-35)

第一作者简介:赵尹毓(1993—)(ORCID: 0000-0002-6149-6527),女,硕士研究生,研究方向为肉品质量安全控制。E-mail: 2016108071@njau.edu.cn

*通信作者简介:张万刚(1977—)(ORCID: 0000-0001-8425-198X),男,教授,博士,研究方向为肉品质量安全控制。E-mail: wangang.zhang@njau.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180109-108

中图分类号:TS201.7

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2019)06-0016-06

引文格式:赵尹毓, 田筱娜, 周光宏, 等. 再生纤维素凝胶对乳清分离蛋白预乳化液稳定性的影响[J]. 食品科学, 2019, 40(6): 16-21.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180109-108. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yinyu, TIAN Xiaona, ZHOU Guanghong, et al. Effect of regenerated cellulose gel on the stability of pre-emulsion with whey protein isolate[J]. Food Science, 2019, 40(6): 16-21. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180109-108. http://www.spkx.net.cn