酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶的异源表达及催化生成糠硫醇

扎木苏1,杨华青1,王 鑫1,孙宝国1,王成涛1,*,卢 松2

(1.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京工商大学,北京 100048;2.阜丰集团内蒙古阜丰生物科技有限公司,内蒙古 呼和浩特 010030)

摘 要: 为明晰糠硫醇生物转化机制,将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)G20的胱硫醚β-裂解酶(cystathionine β-lyase,Str3p)在大肠杆菌(Escherichia coli)中实现异源表达,并验证其催化性质。正交设计试验优化大肠杆菌基因工程菌蛋白表达的诱导条件,其最适诱导表达条件为诱导温度20 ℃、异丙基硫代半乳糖苷浓度0.5 mmol/L、诱导时间13 h。该条件下获得的菌体经超声破碎和镍柱亲和层析,纯化得到的可溶性Str3p分子质量约为52 kDa,其表达量达1.26 mg/mL,较优化前的表达量和酶活力分别提高41.7%和38.6%。实验发现Str3p能够催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物生成糠硫醇,且催化过程受pH值影响较大,在pH 8.0时糠硫醇产量达到47 μmol/L。本研究确定Str3p在E.coli BL21中的异源表达及催化特性,为生物转化合成天然糠硫醇提供新的参考途径。

关键词: 酿酒酵母;胱硫醚β-裂解酶;异源表达;体外催化;糠硫醇

挥发性硫醇类化合物是多种食品(肉制品、水果、蔬菜、茶、咖啡及酒精饮料等)的重要风味成分[1-4],由于其极低香气阈值和独特香气特征[5-6],使其在食品风味形成中扮演着重要角色,成为一类应用广泛的食用香料[7-8]。糠硫醇、3-甲硫基丙醇等硫醇类化合物在中国白酒风味中发挥着特殊作用[9-11],具有强烈的葱香、肉香、烤香和芝麻香等香气特征,被认为是中国芝麻香型白酒的重要香气成分[12-13]

近年研究发现,微生物来源的β-裂解酶参与硫醇类物质的合成,大部分的细菌具有β-裂解酶活力,可以催化裂解醛-半胱氨酸加合物合成硫醇[14-15]。Tominaga等[16]首次发现细菌和植物来源的C—S β-裂解酶可以催化裂解半胱氨酸加合物生成3-巯基-1-己醇(3-mercapto-1-hexanol,3MH)和4-甲基-4-巯基-2-戊酮(4-mercapto-4-methylpentan-2-one,4MMP)。Swiegers等[17]研究发现大肠杆菌中tnaA基因所编码的色氨酸激酶具有强C—S β-裂解酶活力,该基因超表达的工程菌可有效提升其葡萄酒中硫醇类物质含量。虽然多种细菌具有C—S β-裂解酶活力,但这些细菌通常不是食品级微生物,只有少数食品级微生物具有C—S β-裂解酶活力,如S. cerevisiae含有胱硫醚β-裂解酶(cystathionine β-lyase,Str3p),可裂解胱硫醚中的C—S键。Huynh等[18]研究面包酵母在生物转化制备硫醇中的应用。Thibon等[19]报道葡萄酒中酵母菌可催化半胱氨酸加合物生成硫醇类物质。研究发现,有些酵母来源的基因参与硫醇类物质合成,但这些基因及其编码酶在硫醇类物质合成中的作用仍不明晰。本课题组前期研究中,从芝麻香型白酒大曲中筛选获得1 株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)G20,发现菌株可利用半胱氨酸糠醛加合物合成糠硫醇,通过基因超表达和敲除发现Str3基因是糠硫醇合成关键基因[11,20],但其功能还未明晰。

本实验将来源于S. cerevisiae G20的Str3基因重组转化到E. coli BL21中进行超表达,正交设计试验优化重组蛋白Str3p诱导表达条件以提高其表达量,亲和层析纯化后研究Str3p催化生成糠硫醇的能力,该方面研究将为糠硫醇生物转化、发酵食品特征风味形成提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种和质粒

酿酒酵母(S. cerevisiae)G20由本实验室保存;pEASY-E1、大肠杆菌(Escherichia coli)Trans-T1感受态北京全式金生物技术有限公司;大肠杆菌BL21(DE3)北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 培养基与试剂

LB液体培养基:酵母提取物5.0 g/L,胰蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,pH 7.0;LB固体培养基:酵母提取物5.0 g/L,胰蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,琼脂15.0 g/L,pH 7.0。

糠硫醇、L-胱硫醚 美国Sigma公司;半胱氨酸、糠醛、磷酸吡哆醛、咪唑、异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside,IPTG)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA) 北京半夏生物科技有限公司;PrimeSTAR Max Premix(2×)宝生物工程(大连)有限公司;酵母基因组提取试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒、多功能DNA纯化回收试剂盒 北京天根生化科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

PowerPac Basic电泳仪、C1000-Touch聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪 美国Bio-Rad公司;小型高速离心机 美国Sigma公司;SPX-150B生化培养箱 上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;BioSpectrum凝胶成像仪 美国UVP公司;气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 酿酒酵母Str3基因的克隆及重组菌E. coli BL21(pEASY-E1-Str3)的构建

以糠硫醇合成菌株S. c e r e v i s i a e G 2 0的全基因组为模板,设计引物S t r 3-f(ATGCCGATCAAGAGATTAGATACAG)和Str3-r(CTTACAATTTCGAACTCTT)克隆Str3基因,PCR条件:95 ℃变性5 min;95 ℃、30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃、8 s,循环30 次;72 ℃延伸10 min。参考pEASY-E1使用说明,将纯化回收的目的片段与质粒pEASY-E1连接,电击转化至大肠杆菌Trans-T1感受态,菌液涂布于200 μg/mL氨苄青霉素LB抗性平板上。37 ℃培养12 h后挑取单菌落、培养,提取质粒经PCR(T7 Prmoter Primer和Str3-r验证阳性克隆)和测序验证,获取表达载体pEASY-E1-Str3。表达载体经热激转化至宿主菌E. coli BL21(DE3),于200 μg/mL氨苄青霉素LB抗性平板上筛选获得阳性重组子E. coliBL21(pEASY-E1-Str3)。

1.3.2 重组E. coliBL21(pEASY-E1-Str3)的Str3p表达

将培养过夜的重组大肠杆菌E. coliBL21(pEASYE1-Str3)按体积分数1%接种到200 mL LB液体培养基(含200 μg/mL氨苄青霉素)中,37 ℃、200 r/min培养至OD600 nm值为0.4~0.6,加入终浓度为0.3 mmol/L的IPTG于16 ℃、150 r/min诱导9 h,菌液于4 ℃、6 000 r/min离心10 min,菌体经悬浮、洗涤(0.1 mol/L磷酸缓冲液,pH 7.4)后备用。

1.3.3 Str3p的纯化

1.3.3.1 粗酶液提取[20]

将1.3.2节离心收获的菌体重悬于破壁缓冲溶液(含50 mmol/L Tris,pH 8.0,100 mmol/L KCl,10%甘油,0.25 mmol/L Triton X-100,10 mmol/L咪唑,100 μmol/L磷酸吡哆醛)中,冰水浴超声(225 W,超声6 s,间隔3 s)处理10 min,细胞破碎液在4 ℃、12 000 r/min离心10 min,收集的上清液即为粗酶液。

1.3.3.2 HisSep Ni-NTA纯化Str3p[20]

层析柱经平衡缓冲溶液(20 mmol/L Tris,pH 7.0,250 mmol/L KCl,100 μmol/L磷酸吡哆醛和20 mmol/L咪唑)预平衡,设置流速1 mL/min,将上清液加入层析柱,并用30 mL平衡缓冲液(1 mL/min)进行冲洗,随后用洗脱缓冲液(20 mmol/L Tris,pH 7.0,250 mmol/L KCl,100 μmol/L磷酸吡哆醛,200 mmol/L咪唑)进行洗脱,收集洗脱液并于4 ℃保藏备用。

1.3.4 酶活力测定

参考曹珊珊等[21]的方法,并进行一定修改。设置反应体系为100 μL,在5 mmol/L的L-胱硫醚底物溶液(0.1 mol/L K2HPO4溶液配制,pH 7.4)中加入适量酶液(20 μg/mL),37 ℃水浴保温20 min,然后煮沸2 min终止反应,在反应液中加入100 μL 1 mmol/L的2,4-二硝基苯肼和1 mL 0.4 mol/L的NaOH溶液,室温静置30 min。于520 nm波长测定吸光度,以不加酶液的反应液为对照。以不同浓度的丙酮酸钠标准溶液和2,4-二硝基苯肼反应,绘制丙酮酸钠浓度和吸光度之间的标准曲线。

酶活力定义[21]:1 个酶活力单位(1 U)为37 ℃、pH 7.4、1 h能催化产生1 μmol/L丙酮酸的酶量。

1.3.5 蛋白含量测定

采用Bradford法[20-21]测定蛋白质含量并绘制牛血清白蛋白标准曲线。

1.3.6 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

细胞破碎上清液和洗脱液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析目的蛋白纯化结果,使用考马斯亮蓝R-250染色。

1.3.7 诱导条件对Str3p表达量的影响

将培养过夜的重组菌E. coliBL21(pEASY-E1-Str3)按体积分数1%接种到200 mL含有200 μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基中,37 ℃、200 r/min培养至OD600 nm值为0.4~0.6,诱导条件选取IPTG诱导浓度、诱导时间和温度作为影响蛋白表达量的主要因素,研究以上诱导条件对Str3p表达量的影响,同时采用正交设计试验法优化Str3p的表达量。

1.3.7.1 单因素试验

在1.3.7节的培养液中添加IPTG终浓度为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol/L,于16 ℃、150 r/min诱导9 h,收集粗酶液测定酶活力;在培养液中加入终浓度0.5 mmol/L IPTG,控制温度16、20、25、30、37 ℃,150 r/min诱导9 h,收集粗酶液测定酶活力;在培养液中加入终浓度0.5 mmol/L IPTG,于20 ℃、150 r/min分别诱导5、7、9、11、13、15 h,收集粗酶液测定酶活力。

1.3.7.2 正交设计试验优化Str3p酶活力

根据单因素试验结果,选取影响Str3p表达量各因素中有意义的水平,以IPTG浓度、诱导温度和时间为3 个考察因素(表1),选取3 个水平并采用L9(33)正交表进行正交试验设计,确定最适诱导条件并验证。

表1 IPTG诱导条件优化L9(33)正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels used in L9 (33) orthogonal array design for optimization of IPTG induction conditions

水平 因素AIPTG浓度/(mmol/L)B诱导温度/℃C诱导时间/h 1 0.3 16 9 2 0.5 20 11 3 0.7 25 13

1.3.8 Str3p催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物

半胱氨酸-糠醛加合物制备参考Huynh等[18]的方法。催化反应体系500 μL为:50 μg/mL Str3p、50 mmol/L磷酸缓冲液、pH 5.0~8.0、20 μmol/L磷酸吡哆醛、1 mmol/L EDTA、10 mmol/L半胱氨酸-糠醛加合物,30 ℃水浴保温1 h,以添加灭活蛋白的反应液为空白,检测糠硫醇产量。

糠硫醇的检测参考扎木苏等[20]的方法并稍作修改,取500 μL反应液,分别用0.5 mL二氯甲烷萃取2 次,合并萃取液后4 ℃、12 000 r/min离心10 min,取有机层(下层)液体,经0.22 μm有机滤膜过滤装入小瓶密封冷藏,待分析。

气相色谱-质谱条件:T G-5 M S毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度250 ℃,载气He(99.999 5%),流速1.5 mL/min;不分流进样,进样量1.0 μL;升温程序:初始温度35 ℃持续2 min,以10 ℃/min升至280 ℃,恒温15 min;质谱条件:电子电离源,质谱传输线温度230 ℃,离子源温度230 ℃,溶剂延迟3 min,选择离子对监测,糠醛(m/z 96→95)、糠硫醇(m/z 81→53)。

1.4 数据处理

实验中每个处理平行重复3 次,采用SPSS 17.0软件进行数据的处理和分析,采用Origin 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母Str3基因克隆及重组质粒pEASY-E1-Str3的构建结果

图1 PCR克隆重组质粒pEASY-E1-Str3凝胶电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of PCR-amplified pEASY-E1-Str3

M. DL 2000 DNA Marker;1. pEASY-E1-Str3阳性克隆;2.阴性克隆PCR扩增产物。

由图1可知,PCR产物条带约1 400 bp,与预期大小相符。重组质粒经PCR验证和测序分析,确认其大小及测序结果与GenBank中已报道的酿酒酵母Str3基因一致。由图2可知,重组质粒双酶切验证,分别呈现5 700 bp和1 400 bp两条条带,分别与质粒pEASY-E1和Str3基因大小一致;重组质粒条带约7 100 bp,与预期大小相符,说明重组质粒pEASY-E1-Str3构建成功。

图2 重组质粒pEASY-E1-Str3及其酶切凝胶电泳图
Fig. 2 Electrophoresis of pEASY-E1-Str3 and restriction enzyme digestion product

M1. DL 10000 DNA Marker;M2. Supercoiled DNA Ladder Marker;1.重组质粒双酶切;2.重组质粒。

2.2 Str3p异源表达工程菌构建

Str3p经E. coliBL21表达,并在其辅因子(磷酸吡哆醛)存在的情况下,利用镍柱纯化,最终获取目的蛋白。如图3所示,目的蛋白分子质量约为52 kDa,这与酿酒酵母Str3p分子质量的理论计算值(52.7 kDa)一致。重组菌在低温条件下诱导,Str3p表达量较高,其质量浓度约为0.89 mg/mL。Holt等[20]同样表达纯化酿酒酵母VIN 13的Str3p,其分子质量约为52 kDa,与本实验结果一致。

图3 SDS-PAGE分析Str3p纯化结果
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of nickel affinity-purified Str3p

M. Protein Marker;1.诱导后菌体总蛋白;2.纯化后的蛋白;3.诱导前的蛋白。

2.3 诱导条件对工程菌E. coliBL21(pEASY-E1-Str3)的Str3p表达量的影响

2.3.1 IPTG浓度对Str3p表达量的影响

图4 IPTG浓度对Str3p酶活力的影响
Fig. 4 Effect of IPTG concentration on the activity of Str3p

不同小写字母表示差异显著,P<0.05;图6、9同。

如图4所示,IPTG浓度对Str3p酶活力变化有显著影响(P<0.05),随其浓度的增加,Str3p酶活力呈现先增后降的趋势,其中最适IPTG诱导浓度为0.5 mmol/L,当IPTG浓度过高时,可能会影响菌株生长和蛋白的表达,进而导致Str3p酶活力降低。

2.3.2 诱导温度对Str3p表达量的影响

由图5可知,诱导温度对Str3p表达量的影响极显著(P<0.01),Str3p最适诱导温度为20 ℃,随着温度的升高,酶活力逐渐下降。通常温度的升高往往会使蛋白错误折叠形成包涵体,从而失去活力,但过低的温度也会导致菌体生长受到抑制,使蛋白表达量下降。因此,适宜的温度条件下诱导,有利于Str3p的表达。

图5 诱导温度对Str3p酶活力的影响
Fig. 5 Effect of induction temperature on the activity of Str3p

不同小写字母表示差异极显著(P<0.01)。

2.3.3 诱导时间对Str3p表达量的影响

图6 诱导时间对Str3p酶活力的影响
Fig. 6 Effect of induction time on the activity of Str3p

如图6所示,诱导时间对Str3p表达量有显著影响(P<0.05),随诱导时间的延长,Str3p酶活力不断上升,当诱导时间大于13 h时,Str3p酶活力急剧下降,因此认为13 h为适宜的IPTG诱导时间。通常诱导时间短,菌体生长仍处于适应期,蛋白表达量较低,以致酶活力降低。随诱导时间的延长,蛋白表达量增加,但同时可能导致目的蛋白降解及菌体老化,使其得率下降,导致酶活力降低。

2.4 正交设计试验优化Str3p酶活力结果

表2 最适诱导条件优化正交试验设计与结果
Table 2 Design matrix and experimental data for optimization of ITPG-induced expression of Str3p

试验号A IPTG浓度B诱导温度C诱导时间 相对酶活力/%1 1 1 1 72.15 2 87.70 3 1 3 3 78.32 1 2 2 4 93.74 5 2 2 3 100.00 2 1 2 6 88.13 7 3 1 3 84.09 2 3 1 8 81.30 9 3 3 2 74.82 3 2 1 K1 79.39 83.33 80.53 K2 93.96 89.67 85.42 K3 80.07 80.42 87.47 R 14.57 9.25 6.94优化组合A2 B2 C3

根据单因素试验结果,选择对E. coliBL21(pEASYE1-Str3)蛋白表达量影响较大的3 个因素,IPTG浓度(A)、诱导温度(B)和诱导时间(C),采用L9(33)正交表进行正交设计试验,其结果见表2。

由表2可知,3 个因素条件对Str3p表达量的影响大小依次为IPTG浓度>诱导温度>诱导时间,最优诱导条件为A2B2C3,即IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导温度20 ℃、诱导时间13 h。按照优化诱导条件进行3 次平行验证实验,Str3p最高表达量为1.26 mg/mL,与未优化时的表达量(0.89 mg/mL)相比,正交试验优化使得Str3p表达量提高41.7%,且在该条件下酶活力较优化前提高38.6%,明显提高Str3p的表达量及其酶活力,满足后续催化实验需求。

2.5 反应液挥发性成分分析

图7 糠醛(A,5.29 min)和糠硫醇(B,6.52 min)气相色谱-质谱全扫描质谱图[11]
Fig. 7 Full-scan MS spectra recorded at 5.29 min for furfural (A) and at 6.52 min for 2-furfurylthiol (B)

如图7所示,GC-MS分析发现一个保留时间为5.29 min的目标化合物,其离子流图显示特征离子为m/z 95和96,另一个化合物在保留时间为6.52 min处显示的特征离子为m/z 53、81和114,这与NIST谱库中糠醛和糠硫醇的特征离子m/z相匹配。

图8 糠醛和糠硫醇选择离子扫描EIC图
Fig. 8 Comparison of GC-MS/MS chromatograms recorded for furfural and 2-furfurylthiol

A. 7.4 mmol/L糠醛和49.5 μmol/L糠硫醇混合标样;B. Str3p在pH 8.0、底物浓度10 mmol/L时的反应液;下标1~3.分别为总离子流图、糠醛(m/z 96→95)和糠硫醇(m/z 81→53)离子流图。

通过考察标准品的出峰情况,同样在相同的保留时间检出上述特征离子,说明反应液中存在这2 种物质。从图8A可以看出,7.4 mmol/L糠醛和49.5 μmol/L糠硫醇的特征离子对分别在5.29 min和6.52 min出峰,图8B是Str3p催化反应液的出峰情况,其定性离子对与标准品出峰保留时间一致,一方面说明定性结果准确可靠,另一方面证实催化反应生成糠硫醇。

2.6 Str3p催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物

前期研究工作确认酿酒酵母中Str3基因是糠硫醇合成中的关键基因[12],但还需进一步验证其功能。通过异源表达所得的重组蛋白Str3p,其催化生成糠硫醇情况如图9所示,Str3p酶活力受pH值影响较大(P<0.05),随着pH值的升高,催化效率逐渐增加,当pH 8.0时,催化效率达到最大,在底物浓度10 mmol/L、50 μg/mL的Str3p 1 h能催化产生47 μmol/L的糠硫醇。有学者发现细菌来源的C—Sβ裂解酶能催化合成硫醇类物质[16,22-24],其转化率普遍较低。Holt等[20]报道葡萄酒酿造过程中酿酒酵母V13来源的Str3p能够催化裂解半胱氨酸加合物(Cys-3MH,Cys-4MMP),生成12.3 μmol/L 4MMP和2.1 μmol/L 3MH,该酶在pH7.0时,4MMP的产量为pH 7.5时的47%。本研究中重组Str3p的糠硫醇产量在pH 8.0时较pH 7.0提高了近2.7 倍,说明偏碱性条件有利于催化反应的进行。

图9 不同pH值条件下糠硫醇产量
Fig. 9 Production of 2-furfurylthiol at different pH levels

野生酿酒酵母G20中胱硫醚β-裂解酶经异源表达纯化,能够催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物生成糠硫醇,进一步明确Str3基因在糠硫醇合成代谢中的作用。多项研究认为,由半胱氨酸加合物(Cys-3MH和Cys-4MMP)生物转化生成3MH和4MMP的量很低(0.1%~10%)[2,19,25-26]。本研究发现在实验室模拟条件下硫醇类物质生物转化率(低于1%)明显低于真实发酵环境(最高达11%)。由于较低转化率和酵母菌对Cys-thiol的间接催化作用,很可能促使大量的前体物质被分解,并作为氮源、碳源或硫源等被机体所利用,这也与前期所发现的结论基本一致,在发酵或体外催化实验中,有大量糠醛、糠醇(糠醛被还原,仅在发酵体系下检测到)生成[12]。因此,对于糠硫醇生物合成分子机制,需要继续挖掘具有高效转化功能的酵母菌株,加强开发体系中这些未被利用的前体物质,以提升白酒及相关发酵食品特征风味。

3 结 论

通过基因工程技术构建高效表达Str3p的工程菌E. coli BL21(pEASY-E1-Str3),正交设计试验优化其蛋白诱导条件,并以半胱氨酸-糠醛加合物为底物,验证Str3p的催化作用。研究发现在诱导剂IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导温度20 ℃、诱导时间13 h时,重组Str3p质量浓度为1.26 mg/mL,蛋白表达量和酶活力较优化前分别提高41.7%和38.6%;纯化后Str3p受反应pH值条件影响较大,在pH 8.0时,能够催化裂解半胱氨酸-糠醛加合物(10 mmol/L)生成47 μmol/L糠硫醇。该研究结果将为天然硫醇类香料绿色制造、发酵食品特征风味形成提供理论支持和技术指导。

参考文献:

[1] KERSCHER R, GROSCH W. Quantification of 2-methyl-3-furanthiol,2-furfurylthiol, 3-mercapto-2-pentanone, and 2-mercapto-3-pentanone in heated meat[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998,46(5): 1954-1958. DOI:10.1021/jf970892v.

[2] TOMINAGA T, FURRER A, HENRY R, et al. Identification of new volatile thiols in the aroma of Vitis vinifera l. var. Sauvignon blanc wines[J]. Flavour and Fragrance Journal, 1998, 13(3): 159-162.DOI:10.1002/(sici)1099-1026.

[3] TOMINAGA T, GUIMBERTAU G, DUBOURDIEU D. Role of certain volatile thiols in the bouquet of aged champagne wines[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(4): 1016-1020.DOI:10.1021/jf020755k.

[4] VERMEULEN C, LEJEUNE I, TRAN T T, et al. Occurrence of polyfunctional thiols in fresh lager beers[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(14): 5061-5068. DOI:10.1021/jf060669a.

[5] TOMINAGA T, BLANCHARD L, DARRIET P, et al. A powerful aromatic volatile thiol, 2-furanmethanethiol, exhibiting roast coffee aroma in wines made from several Vitis vinifera grape varieties[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(5): 1799-1802.DOI:10.1021/jf990660r.

[6] MOTTRAM D S. The effect of cooking conditions on the formation of volatile heterocyclic compounds in pork[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36(5): 377-382. DOI:10.1002/jsfa.2740360510.

[7] GUTH H, GROSCH W. 12-Methyltridecanal, a species-specific odorant of stewed beef[J]. LWT-Food Science and Technology, 1993,26(2): 171-177. DOI:10.1006/fstl.1993.1035.

[8] TOMINAGA T, DUBOURDIEU D. A novel method for quantification of 2-methyl-3-furanthiol and 2-furanmethanethiol in wines made from Vitis vinifera grape varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(1): 29-33. DOI:10.1021/jf050970b.

[9] BAILLY S, JERKOVIC V, MARCHAND-BRYNAERT J, et al.Aroma extraction dilution analysis of sauternes wines. Key role of polyfunctional thiols[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006, 54(19): 7227-7234. DOI:10.1021/jf060814k.

[10] YIN S, LANG T, XIAO X, et al. Significant enhancement of methionol production by co-expression of the aminotransferase gene ARO8 and the decarboxylase gene ARO10 in Saccharomyces cerevisiae[J]. FEMS Microbiology Letters, 2015, 362(5): 1-7. DOI:10.1093/femsle/fnu043.

[11] ZHA M S, SUN B G, YIN S, et al. Generation of 2-furfurylthiol by carbon-sulfur lyase from the Baijiu yeast Saccharomyces cerevisiae G20[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2018, 66(9):2114-2120. DOI:10.1021/acs.jafc.7b06125.

[12] ZHA M S, YIN S, SUN B G, et al. STR3 and CYS3 contribute to 2-furfurylthiol biosynthesis in Chinese sesame-f l avored Baijiu yeast[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65: 5503-5511.DOI:10.1021/acs.jafc.7b01359.

[13] SHA S, CHEN S, QIAN M, et al. Characterization of the typical potent odorants in Chinese roasted sesame-like fl avor type liquor by headspace solid phase microextraction-aroma extract dilution analysis,with special emphasis on sulfur-containing odorants[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2017, 65(1): 123-131. DOI:10.1021/acs.jafc.6b04242.

[14] TROCCAZ M, BENATTIA F, BORCHARD G, et al. Properties of recombinant staphylococcus haemolyticus cystathionine beta-lyase(metC) and its potential role in the generation of volatile thiols in axillary malodor[J]. Chemistry & Biodiversity, 2008, 5(11): 2372-2385. DOI:10.1002/cbdv.200890202.

[15] YOSHIDA Y, NEGISHI M, AMANO A, et al. Differences in the βC-S lyase activities of viridans group streptococci[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 300(1): 55-60.DOI:10.1016/s0006-291x(02)02803-6.

[16] TOMINAGA T, PEYROT DES GACHONS C, DUBOURDIEU D. A new type of fl avor precursors in Vitis viniferal. L. cv. Sauvignon blanc:S-cysteine conjugates[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1998, 46(12): 5215-5219. DOI:10.1021/jf980481u.

[17] SWIEGERS J H, CAPONE D L, PARDON K H, et al. Engineering volatile thiol release in Saccharomyces cerevisiae for improved wine aroma[J]. Yeast, 2007, 24(7): 561-574. DOI:10.1002/yea.1493.

[18] HUYNH-BA T, MATTHEY-DORET W, FAY L B, et al. Generation of thiols by biotransformation of cysteine-aldehyde conjugates with baker's yeast[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003,51(12): 3629-3635. DOI:10.1021/jf026198j.

[19] THIBON C, MARULLO P, CLAISSE O, et al. Nitrogen catabolic repression controls the release of volatile thiols by Saccharomyces cerevisiae during wine fermentation[J]. FEMS Yeast Research, 2008,8(7): 1076-1086. DOI:10.1111/j.1567-1364.2008.00381.x.

[20] HOLT S, CORDENTE A G, WILLIAMS S J, et al. Engineering Saccharomyces cerevisiae to release 3-mercaptohexan-1-ol during fermentation through overexpression of an S. cerevisiae gene, STR3,for improvement of wine aroma[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(11): 3626-3632. DOI:10.1128/aem.03009-10.

[21] 曹珊珊, 牛卫宁, 羊梦林, 等. 胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究[J]. 化学与生物工程, 2011, 28(9): 27-31.

[22] MASNEUF-POMARÈDE I, MANSOUR C, MURAT M L, et al.Inf l uence of fermentation temperature on volatile thiols concentrations in Sauvignon blanc wines[J]. International Journal of Food Microbiology,2006, 108(3): 385-390. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2006.01.001.

[23] SUBILEAU M, SCHNEIDER R, SALMON J M, et al. New insights on 3-mercaptohexanol (3MH) biogenesis in Sauvignon blanc wines:Cys-3MH and (E)-hexen-2-al are not the major precursors[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(19): 9230-9235.DOI:10.1021/jf801626f.

[24] PEYROT D E S, GACHONS C, TOMINAGA T, et al. Measuring the aromatic potential of Vitis vinifera l. cv. Sauvignon blanc grapes by assaying S-cysteine conjugates, precursors of the volatile thiols responsible for their varietal aroma[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(8): 3387-3391. DOI:10.1021/jf990979b.

[25] DUBOURDIEU D, TOMINAGA T, MASNEUF I, et al. The role of yeasts in grape fl avor development during fermentation: the example of Sauvignon blanc[J]. American Journal of Enology and Viticulture,2006, 57(1): 81-88. DOI:10.1016/j.scienta.2005.07.007.

[26] MURAT M L, MASNEUF I, DARRIET P, et al. Effect of Saccharomyces cerevisiae yeast strains on the liberation of volatile thiols in Sauvignon blanc wine[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2001, 52(2): 136-139. DOI:10.1016/S0065-2164(01)49013-7.

Heterologous Expression of Recombinant Cystathionine β-Lyase from Saccharomyces cerevisiae and Catalytic Synthesis of 2-Furfurylthiol

ZHA Musu1, YANG Huaqing1, WANG Xin1, SUN Baoguo1, WANG Chengtao1,*, LU Song2
(1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology & Business University (BTBU), Beijing 100048, China;2. Neimenggu Fufeng Biotechnologies Co. Ltd., Hohhot 010030, China)

Abstract: In order to clarify the bioconversion mechanism of 2-furfurylthiol, we cloned the cystathionine β-lyase gene(Str3) from Saccharomyces cerevisiae G20 and expressed it in Escherichia coli BL21, and we further evaluated the catalytic activity of the recombinant enzyme. With the use of orthogonal array design, the optimized induction conditions for the recombinant strain were determined as follows: temperature 20 ℃, IPTG concentration 0.5 mmol/L, and time 13 h. The recombinant Str3p was harvested after ultrasonic disruption of the cells and purified by Ni column affinity chromatography and its molecular mass was measured to be about 52 kDa. The content of soluble Str3p was up to 1.26 mg/mL, the expression level and the enzymatic activity were increased by about 41.7% and 38.6%, respectively, compared with those before optimization. The recombinant Str3p was capable of catalyzing the degradation of cysteine-furfural conjugate into 2-furfurylthiol. The process was greatly inf l uenced by pH value, and the maximum yield of 2-furfurylthiol of 47 μmol/L was obtained at pH 8.0. This study can provide useful information on biosynthesis of 2-furfurylthiol.

Keywords: Saccharomyces cerevisiae; cystathionine β-lyase; heterologous expression; in vitro catalysis; 2-furfurylthiol

收稿日期:2018-01-31

基金项目:国家自然科学基金面上项目(31571801);“十三五”国家重点研发计划重点专项(2016YFD0400802;2016YFD0400502);北京市科技创新服务能力建设-科技成果转化-提升计划项目(PXM2018-014213-000033);北京市科技计划项目(Z171100002217019)

第一作者简介:扎木苏(1988—)(ORCID: 0000-0002-9167-7863),男,博士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail: 275245204@qq.com

*通信作者简介:王成涛(1969—)(ORCID: 0000-0002-4139-1058),男,教授,博士,研究方向为食品生物技术。E-mail: wct5566@163.com

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180131-430

中图分类号:TS201.3

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2019)06-0055-07

引文格式:扎木苏, 杨华青, 王鑫, 等. 酿酒酵母胱硫醚β-裂解酶的异源表达及催化生成糠硫醇[J]. 食品科学, 2019, 40(6): 55-61.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180131-430. http://www.spkx.net.cn

ZHA Musu, YANG Huaqing, WANG Xin, et al. Heterologous expression of recombinant cystathionine β-lyase from Saccharomyces cerevisiae and catalytic synthesis of 2-furfurylthiol[J]. Food Science, 2019, 40(6): 55-61. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180131-430. http://www.spkx.net.cn