食品过敏是指人在摄入某种食物之后产生的一种不良反应,在医学上属于变态反应的一种,可以引起身体一些组织和器官甚至全身出现强烈反应[1-2]。食品过敏在全世界都有广泛影响,大约包括5%儿童及3%~4%成年人,并呈上升趋势[3]。WHO/FAO认证的8 大类过敏食物包括花生、鱼、贝类、奶、蛋、大豆、坚果和小麦,它们引发了约90%食物过敏反应[4]。在这8 大类过敏原中花生过敏因其高度危险性、终身性和不可治愈性受到较大关注[5]。据调查,花生过敏在世界范围内都相对普遍,美国有1.1%的人对花生过敏[6],在法国花生过敏的人数约为0.3%~0.75%[7],丹麦有0.2%~0.4%的人群对花生过敏[8]。目前在花生中已发现了17 种过敏蛋白[9],其中Ara h 1和Ara h 2被认为是两种最主要的过敏原,Ara h 1占花生蛋白总量的12%~16%[10],为花生中含量最高的过敏原,与豌豆球蛋白具有高度同源性,易引发交叉反应[11]。Shin等[12]的研究发现Ara h 1蛋白含有23 个抗原表位,且热稳定性强,耐酶解,故能激活树突状抗原提呈细胞而导致机体发生过敏反应。
在进行Ara h 1过敏性研究时,从花生中提取的天然花生蛋白无疑最能体现其原本的致敏性,但是天然蛋白也有其不可避免的缺点[13]。首先在提取过程中,步骤繁多,会导致蛋白损失降解,活性下降;其次提取制备高纯度蛋白难度较高,蛋白组分复杂对其致敏性的研究有较大影响。这些原因使得提取天然过敏原难以标准化、程序化、量产化。相较与提取天然过敏原,利用重组技术原核表达过敏原重组蛋白有产量高、易纯化、质量稳定等优点,且具有与天然过敏原相似的免疫学特性,可以作为天然过敏原的代替物研究其过敏性[14]。
目前对过敏原蛋白致敏性的评价方法主要有生物信息学、血清学、模拟胃液消化、动物模型和细胞模型五种方法[15]。其中BALB/c小鼠是最常用的过敏动物模型。BALB/c小鼠是近交系小鼠,个体间差异较小,且BALB/c小鼠以Th2型细胞应答为主导,在受到过敏原刺激后更易产生高应答,所以广泛应用于免疫学研究[16]。在对BALB/c小鼠致敏后,可以通过检测小鼠组织的病理变化情况,特异性抗体、活性介质、细胞因子的含量,以及免疫细胞形态的变化综合评价过敏原的致敏性。Moghaddam等[17]使用BALB/c小鼠建立花生过敏模型,尝试了多种免疫流程致敏小鼠,结果表明烘烤后花生的致敏性提高。
大鼠嗜碱性白血病(rat basophilic leukemia,RBL)细胞属于肥大细胞系细胞,其表面有高亲和力的IgE受体FcεRI,可以与IgE特异性结合处于敏化状态,当过敏原再次被摄入时,与致敏细胞表面相邻的两个或两个以上的IgE特异性结合,使得膜表面的FcεRI交联活化,引发了肥大细胞的脱颗粒释放组胺、β-己糖苷酶(hexosaminidase,β-HXA)等活性介质,在过敏反应中起关键作用[18,31]。因此在过敏反应的机制研究和检测中有广泛的应用。罗霞等[19]利用RBL-2H3细胞对几种中药注射液的潜在致敏性进行探究。Sun Na等[20]在比较了两种RBL细胞系后,选用RBL-2H3建立了过敏原鉴定和临床诊断的细胞模型。鉴于此,本实验拟用BALB/c小鼠和RBL细胞模型研究重组Ara h 1蛋白的致敏性(图1)。
图1 本研究拟实验思路图
Fig. 1 Graphic abstract of this study
花生品种为四粒红,市售。
TRIzon 康为世纪生物科技有限公司;大肠杆菌E. coli DH5α、E. coli Rosetta(DE3)、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶HindIII、SalI、T4连接酶、PrimeScript™RT Master Mix、琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒、DNA Marker(DL5000) 宝生物工程(大连)有限公司;Ni亲和层析树脂 德国Qiagen公司;高保真酶Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase南京诺唯赞生物科技有限公司;HRP-羊抗兔IgG1、HRP-羊抗兔IgG2a、HRP-羊抗兔IgE 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;IL-4、IL-5、IFN-γ、组胺ELISA试剂盒 上海宝曼生物科技有限公司;氨基己糖(4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide,PNAG)美国Sigma公司;其他试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
DNA水平电泳槽、蛋白垂直电泳槽、凝胶图像分析系统 上海天能科技有限公司;EMax Plus单功能光吸收酶标仪 美国Molecular Devices公司;650E超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司;4530R低温高速离心机 德国Eppendorf公司;BX51光学显微镜日本奥林巴斯公司。
1.3.1 pET-28a-Ara h 1表达载体的构建
根据GenBank已报道的花生过敏原Ara h 1的基因序列设计扩增引物,在上游引物的5′端引入HindIII酶切位点和保护碱基CCC,在下游引物3′端引入S a l I酶切位点和保护碱基ACGC。上游引物:5′-CCCAAGCTTCGATGGCCGTCACCCCCAG CCTGCTG-3′;下游引物:5′-ACGCGTCGACTCA G C T G C A G G A A T T T T G G C A G G-3′。使用TRIzon法提取花生总RNA,将花生子叶在液氮中充分研磨后取30~50 mg放入RNase-Free离心管中,加入1 mL TRIzon混匀,室温放置5 min,加入0.2 mL氯仿,剧烈振荡15 s,室温放置2~3 min。4 ℃、12 000 r/min离心15 min,去上清液,转移到新的RNase-Free离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,放置10 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min,弃上清液。加入1 mL的75%乙醇溶液洗涤沉淀,4 ℃、12 000 r/min离心3 min,弃上清液,放置2~3 min晾干,加入50 μL无RNase水溶解,-80 ℃保存。
用PrimeScript™ RT Master Mix试剂进行反转录反应,反应体系为5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL,RNA≤500 ng,加Rnase-Free ddH2O至10 μL。37 ℃孵育15 min,85 ℃、5 s使反转录酶失活。
用高保真酶Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase试剂进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),反应体系为Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL,2×Phanta Max Buffer 25 μL,dNTP Mix 1 μL,上下游引物(10 mmol/L)2×2 μL,模板DNA 3 μL,ddH2O 16 μL。扩增条件:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸60 s共30 个循环,72 ℃彻底延伸5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,将目的条带割胶回收,用HindIII和SalI双酶切pEt-28a载体和回收条带,用T4连接酶连接酶切后的目的基因和载体片段,构建重组表达质粒,转入E. coli DH5α感受态细胞,在含有卡那霉素的LB平板上筛选阳性质粒。将阳性菌落扩大培养,提取质粒进行双酶切鉴定,送生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序后用BLAST工具对结果进行序列对比分析。
1.3.2 Ara h 1蛋白的原核表达
比对成功的质粒转入E. coli Rosetta(DE3)宿主表达菌中扩大培养,当菌液OD600 nm约为0.5~0.6时加入异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)至终浓度为1 mmol/L诱导表达6 h。将表达完成的菌液3 000 r/min离心10 min收集细菌沉淀,将沉淀用超声破菌缓冲液重悬后对细菌进行破碎,超声破碎条件为功率300 W、超声3 s停3 s,至菌液澄清透亮为止,该溶液中的蛋白即为全菌蛋白。将超声破碎的菌液12 000 r/min离心15 min,上清液即为上清蛋白,沉淀为包涵体蛋白。将包涵体蛋白置于包涵体溶解液中4 ℃搅拌5~8 h至无沉淀,再将溶解好的溶液置于透析袋中,放入尿素浓度依次为6 mol/L-4 mol/L-2 mol/L-1 mol/L-0 mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)中透析,逐步将蛋白溶液中的尿素去除,完成包涵体蛋白的溶解复性。
1.3.3 重组Ara h 1蛋白的纯化及鉴定
将溶解复性的包涵体蛋白与适量的镍离子树脂混合,4 ℃置于旋转混合仪上旋转混匀2 h。将充分混合作用的溶液加入纯化柱中,先用含30 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液洗掉杂蛋白,再用含300 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白(洗脱缓冲液体积约为镍离子树脂体积的3 倍,过多会稀释目的蛋白的浓度),收集洗脱液,即为纯化的重组蛋白。将重组蛋白的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)胶条送至基云(上海)生物科技有限公司进行质谱鉴定。
1.3.4 天然Ara h 1蛋白的纯化
将花生粉碎后放入pH 7.4的Tris-HCl(1∶20(g/mL))中搅拌4 h,12 000 r/min离心30 min,取中间澄清溶液,装入透析袋中20 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl中透析除NaCl。打开AKTA蛋白纯化仪清洗装置,设置清洗速率2.0 mL/min,洗至平线。装柱,洗掉DEAESepharose Fast Flow柱中乙醇,15 min洗至平线,将A1管放入20 mmol/L、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中,平衡3~5 个柱体积。上样用一次性注射器将50 mg蛋白粗提液经装置进入柱中,15 min后,用20 mmol/L、pH 7.4的Tris-HCl缓冲液洗至平线。洗脱时,将A2管放入1 mmol/L NaCl溶液中,设置每管洗脱体积4 mL,洗脱时间340 min。洗脱完成后收集0.2~0.3 mol NaCl所对应的蛋白。最后清洗柱子,将A2管放入水中,2 mL/min清洗60 min后,将A2管放入乙醇中,20 min后取下柱子。SDS-PAGE验证每管收集的蛋白。
1.3.5 小鼠的致敏流程
将15 只BALB/c小鼠分为PBS对照组(5 只)、重组Ara h 1蛋白致敏组(10 只)、天然Ara h 1蛋白致敏组(10 只)。致敏方式为腹腔注射5 次,每次注射100 μL蛋白(0.1 μg/μL),每次间隔1 周。5 周后进行大剂量激发(腹腔注射5 倍剂量),30 min后将小鼠摘眼球取血处死,取出空肠组织和肺组织,血液4 ℃沉降过夜后吸出上层血清,-20 ℃保存。
1.3.6 小鼠空肠、肺病理切片的观察
小鼠空肠组织和肺组织,剪成适当大小的体积,泡在体积分数10%中性甲醛溶液中固定,石蜡包埋后切片,苏木精-伊红染色。光学显微镜下观察组织的病理变化情况。
1.3.7 血液中特异性抗体与细胞因子含量的测定
将100 μL花生蛋白(0.1 mg/mL)加入96 孔板中,4 ℃包被过夜。ELISA洗液洗板(3 次,每次3 min,下同),加入200 μL 5%的脱脂奶粉37 ℃封闭2 h。ELISA洗液洗板后每孔加入200 μL稀释1 000 倍的小鼠血清37 ℃孵育2 h。ELISA洗液洗板,每孔加入200 μL羊抗鼠HRP-IgE(1∶1 000)/羊抗鼠HRP-IgG1(1∶10 000)/羊抗鼠HRP-IgG2a(1∶1 000)37 ℃孵育2 h。ELISA洗液洗板后加入200 μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺显色底物,37 ℃避光孵育15 min,最后加入50 μL终止液终止反应,测OD450 nm值。
IL-4、IL-5、IFN-γ、组胺含量的检测方法见上海宝曼生物科技有限公司ELISA试剂盒说明书。
1.3.8 RBL-2H3细胞模型对重组Ara h 1蛋白致敏性的评估
将处于对数生长期的RBL细胞(5×105 个/mL)接种到96 孔板中,每孔200 μL,培养24 h后PBS洗涤3 次,加入含有过敏血清的培养液,再培养24 h后用Tyrode's缓冲液洗涤3 次,实验组加入50 μL重组Ara h 1蛋白(10 ng/mL),全部释放组加入50 μL 1% Triton-X100,空白组加入50 μL Tyrode's缓冲液,反应45 min后放入冰盒中终止反应。转移30 μL上清液至另一96 孔板,每孔中加入5 mmol/L PNAG-柠檬酸溶液50 μL,37 ℃孵育1 h。1 h后每孔加入200 μL碳酸氢钠缓冲液显色,酶标仪测OD450 nm。按下式计算实验组β-HXA的释放率:
采用SPSS统计软件进行数据处理。P<0.05,差异显著。
2.1.1 pET-28a-Ara h 1表达载体的构建及测序
提取花生全RNA,电泳检测其反转录PCR扩增产物,由图2A可知,在2 000 bp左右有一条明亮条带,大小与已公布的Ara h 1基因(1 845 bp)大小基本相符。将目的条带与pET-28a载体双酶切后连接,构建pET-28a-Ara h 1表达载体并进行双酶切鉴定,由图2B可见,5 000 bp左右处的条带为pET-28a载体,2 000 bp处的条带为Ara h 1基因。测序和BLAST工具分析显示与已公布的Ara h 1基因序列相似度100%,表明Ara h 1基因已被成功克隆且已连接到pET-28a表达载体上。
图2 Ara h 1基因的克隆(A)与pET-28a-Ara h 1载体(B)的双酶切鉴定
Fig. 2 Cloning of Ara h 1 gene (A) and identi fi cation of plasmid pET-28a-Ara h 1 (B)
2.1.2 重组Ara h 1蛋白的诱导表达与纯化
图3 重组Ara h 1蛋白的诱导表达与纯化
Fig. 3 Expression and purification of recombinant Ara h 1
M.标准蛋白Marker。A:1~3.对照、30 ℃诱导、16 ℃诱导菌液全菌;4~6.对照、30 ℃诱导、16 ℃诱导菌液上清液;7~9.对照菌液、30 ℃诱导表达、16 ℃诱导菌液包涵体。B:1.透析复性的包涵体蛋白;2、3.经过纯化的目的蛋白;4.洗涤掉的杂蛋白。
将表达载体转入Rosetta(DE3)宿主表达菌中,在16、30 ℃下诱导表达,提取全菌、上清液、包涵体蛋白,SDS-PAGE分析在不同温度下重组蛋白的表达情况,结果如图3A所示,在全菌中,30 ℃诱导有重组蛋白表达,16 ℃基本无表达;而在上清液中,30 ℃和16 ℃均无明显表达;在包涵体中,30 ℃诱导蛋白表达量高于16 ℃诱导,故用30 ℃为诱导表达条件,且重组Ara h 1蛋白以包涵体形式表达,重组蛋白大小约为75 kDa,与预计相符。将包涵体蛋白溶解后透析复性,用镍离子吸附柱纯化带有His标签的重组蛋白,SDS-PAGE的结果(图3B)表明纯化后目的蛋白条带单一,纯度较高。进一步对重组蛋白样品进行二级质谱分析(图4),用MASCOT软件进行数据库检索比对,得分为14 994,经鉴定重组蛋白为Ara h 1过敏原。
图4 重组Ara h 1蛋白的鉴定
Fig. 4 Identification of recombinant Ara h 1
红色标注的氨基酸为质谱鉴定到的肽段部分。
2.2.1 重组Ara h 1蛋白和天然Ara h 1致敏BALB/c小鼠的血清学分析
按1.3.5节致敏流程致敏小鼠,5 周后处死小鼠后取血清,测特异性抗体(IgE、IgG1、IgG2a)、细胞因子(IL-4、IL-5、IFN-γ)和组胺的含量。由图5A、B可见,重组蛋白和天然蛋白致敏的小鼠血清中IgE、IgG含量均显著高于PBS组小鼠,表明重组蛋白与天然蛋白一样具有致敏性,且重组蛋白与天然蛋白相比有更高的致敏性。在两组小鼠中IgG1滴度明显高于IgG2a,故IgG1/IgG2a比值均大于1,表明在两组小鼠体内过敏反应均为Th2型。细胞因子的测定结果(图5C)显示重组Ara h 1蛋白和天然Ara h 1致敏的小鼠血清中Th2型细胞因子IL-4和IL-5较PBS组有明显升高,而Th1型细胞因子IFN-γ与对照组相比无明显变化,进一步证实重组Ara h 1蛋白与天然蛋白类似,可以通过上调Th2型细胞因子,下调Th1型细胞因子引发小鼠Th2型过敏反应的发生。另外,重组Ara h 1蛋白和天然Ara h 1蛋白致敏的小鼠血清中组胺含量都明显升高,也证明重组Ara h 1蛋白与天然Ara h 1蛋白一样可以引发BALB/c小鼠过敏反应。
图5 重组Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠的血清学分析
Fig. 5 Serological analysis of BALB/c mice sensitized to recombinant Ara h 1
A.小鼠血清中特异性IgE含量;B.小鼠血清中特异性IgG1、IgG2a含量;C.小鼠血清中细胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ和组胺含量。*.P<0.05,差异显著;**.P<0.01,差异极显著;***.P<0.005,差异高度显著。
2.2.2 重组Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠的病理学分析
处死小鼠后,取空肠和肺组织,制成苏木精-伊红染色切片。空肠苏木精-伊红切片(图6)显示PBS组小鼠肠绒毛整齐清晰,没有明显损伤,肠壁平整光滑;而重组蛋白致敏小鼠的空肠出现了肠绒毛断裂、肠壁破损增厚的现象,表明重组蛋白引起了BALB/c小鼠出现肠黏膜损伤和病变,提示重组Ara h 1花生蛋白可能存在一定的致敏性。
图6 重组Ara h 1蛋白致敏小鼠的空肠病理切片
Fig. 6 Pathological section of jejunum
A. PBS对照组;B.重组Ara h 1蛋白致敏组。图7同。
由肺组织病理切片(图7)可知,PBS组小鼠支气管壁完整清晰,肺泡均匀完整,未见炎性细胞浸润现象和充血现象;而在重组Ara h 1蛋白处理小鼠的肺切片中,肺支气管、肺泡均发生不同程度的炎症现象,包括小鼠肺支气管和肺泡充血,肺支气管破损和炎性细胞浸润。表明重组Ara h 1蛋白可导致小鼠肺部发生炎症病变,进一步说明重组Ara h 1蛋白具有一定的致敏性。
图7 重组Ara h 1蛋白致敏小鼠的肺泡和肺支气管病理切片
Fig. 7 Pathological section of lung
2.2.3 RBL细胞模型对重组Ara h 1蛋白致敏性的评价
用重组Ara h 1蛋白刺激小鼠的血清致敏RBL细胞,检测β-HXA释放率,由图8可见,重组Ara h 1蛋白组有更高β-HXA的释放量,RBL细胞模型进一步确认重组Ara h 1蛋白具有致敏性。
图8 重组蛋白对RBL-2H3细胞释放β-HXA的影响
Fig. 8 Release rate ofβ-HXA in RBL-2H3 cells stimulated by recombinant Ara h 1
花生过敏反应是典型的由IgE介导的I型超敏反应,对全身诸多脏器产生影响,可以引起面部以及喉部水肿,皮肤红肿,血压升高,甚至引发休克[21]。重组蛋白用于花生过敏原研究具有重要的意义[22]。重组表达系统主要有原核表达系统、真核表达系统和无细胞表达系统,其中大肠杆菌表达系统繁殖速度快、成本低、操作简单、表达量高,是最常用的重组表达系统[23]。
但是大肠杆菌系统也有缺乏糖基化和磷酸化修饰、容易形成不溶的包涵体的缺点。pET-28a载体是最常用的大肠杆菌表达系统载体,可以表达带有His tag的融合蛋白,通过Ni离子亲和纯化可以简便快速地得到目的蛋白[24]。据报道,Ara h 1为最重要的花生过敏原之一,本实验拟探究Ara h 1蛋白对小鼠的致敏机制,故构建了pET-28a-Ara h 1表达载体,使用Rosetta大肠肝菌原核表达重组Ara h 1蛋白,由于重组蛋白以包涵体的形式表达,所以采用了高浓度的尿素将其溶解后梯度透析复性的方法得到可溶性蛋白,进行后续的研究。
动物模型中过敏反应发生的机制十分复杂,所以在判断过敏原致敏性大小时需要综合参考多个指标。刘志刚等在建立花生过敏模型时观察了空肠的病理切片,发现过敏反应可以导致空肠损伤病变[25]。Zhang Wenju等[26]通过检测不同处理的Ara h 2致敏小鼠后小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IFN-γ、组胺的含量来研究热处理对花生蛋白Ara h 2致敏性影响。陈同强等[27]在建立龙虾过敏小鼠模型时,主要通过ELISA测定小鼠血清中IgE、组胺以及被动皮肤过敏实验检测IgE抗体滴度评价龙虾过敏。本研究结果显示在重组Ara h 1蛋白致敏BALB/c小鼠后,血清中特异性抗体(IgE、IgG)水平显著升高,且IgG1/IgG2a大于1,呈Th2型过敏反应趋势;Th1型细胞因子(IFN-γ)无变化、Th2型细胞因子(IL-4、IL-5)水平升高验证并解释了Th2型过敏反应发生的机理[28];组胺释放水平的显著上升,进一步证实了重组Ara h 1蛋白的致敏性;观察了小鼠的空肠和肺切片,有明显病变发生,推测是由于组胺及其他炎性介质释放导致。经过与天然Ara h 1蛋白致敏小鼠血清中特异性抗体、细胞因子和组胺含量的对比,发现重组Ara h 1蛋白具有与天然Ara h 1蛋白相似的致敏性,均可以引发小鼠Th2型过敏反应的发生。
RBL细胞模型是最常见的致敏原细胞评价体系,这是由于RBL-2H3细胞系功能类似于体内的肥大细胞,体外模拟了过敏反应的发敏阶段[29]。在致敏阶段,IgE与肥大细胞表面FcεRI受体的胞外结构域结合,当相应抗原再次进入机体后,小片段的抗原决定簇将肥大细胞表面的两个或两个以上的IgE特异性结合,导致FcεRI的交联,引发了肥大细胞的脱颗粒,这是过敏反应中最重要的环节。由于在RBL细胞中组胺表达量较少,且组胺半衰期较短,故通过检测β-HXA含量判断RBL脱颗粒水平[30-31]。本实验中,重组Ara h 1蛋白具有更强的使RBL细胞脱颗粒的能力,这与小鼠实验中重组蛋白致敏的小鼠血清中有大量组胺释放的结果相互印证,更进一步证明了重组Ara h 1蛋白存在致敏性。
综上所述,本实验成功重组表达了花生蛋白Ara h 1,且经过验证重组Ara h 1蛋白具有一定的致敏性,且与天然Ara h 1蛋白相似。
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