爽口性是啤酒口感的重要评价指标之一,也是啤酒中多种化合物相互共同作用的结果。Martina等[1]将啤酒口感归入除化学刺激(包括嗅觉与味觉)外由物理化学多因素作用引起的机械刺激。Alex[2]也将口感列为触觉感受。它不像啤酒风味中的嗅觉与味觉的研究,可采取外添加标准物质的方法来确定感官感受与风味物质之间的对应性,从而明确关键风味化合物,并进一步进行发酵过程变化规律及相关机理与风味调控的研究。由于啤酒口感受到多方面因素影响,其物理化学交互作用显著,因此上述研究方法并不适用。Miyashita等[3]将啤酒口感中的顺滑、脆爽、干净、回味等感官感受整合为爽口性的概念,通过专用气相色谱仪分析上百种风味物质并与品评结合,通过偏最小二乘判别分析(partial least squaresdiscrimination analysis,PLS-DA)法建立数学模型,对未知啤酒样品的爽口性进行预测。在此过程中选择7 种重要变量(VIP>1):辛酸、辛酸乙酯、癸酸、癸酸乙酯、异戊醇、香叶烯、乙酸苯乙酯,其中除异戊醇外其余指标均与爽口性呈负相关。
顶空固相微萃取(h e a d s p a c e s o l i d-p h a s e microextraction,HS-SPME)结合气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)联用技术是目前研究食品风味的重要手段,广泛应用于葡萄酒[4-6]、啤酒[7-10]及白酒[11-13]等酒精饮料中风味物质的定性定量研究,并在质量控制及食品安全方面也起到了重要作用[14]。PLS-DA基于PLS回归方法,具有简单高效的特点,已经被广泛应用[15-24]。
本研究利用HS-SPME-GC-MS技术检测啤酒中7 种有爽口性相关的关键风味物质,与品评结果一同转化为数学矩阵,并利用PLS-DA方法对其进行建模分析,建立一种快速简便的啤酒爽口性判定方法。
不同生产商及生产日期的77 份Lager啤酒样品 市购。
标准品(纯度):辛酸(≥98%)、辛酸乙酯(≥98%)、癸酸(≥98%)、癸酸乙酯(≥98%)、异戊醇(≥99%)、香叶烯(≥98%)、乙酸异戊酯(≥98%) 美国Sigma-Aldrich公司;乙醇(分析纯)天津恒兴化学试剂有限公司。
S Q 8 C GC-M S联用仪、D B-5M S毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.50 μm) 美国Perkin Elmer公司;PAL COMBI-xt自动进样器 瑞士CTC公司;65 μm聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯涂层纤维、20 mL带PTFE涂层硅橡胶垫的顶空瓶 美国Sigma-Aldrich公司;Milli-Q纯水器 美国Millipore公司。
1.3.1 标准溶液的配制及校准曲线的制定
分别将25 mg标准品溶于25 mL 5%乙醇溶液中,配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准溶液,用于校准曲线的制定。
1.3.2 HS-SPME样品制备
取5 mL排气啤酒样品置于20 mL顶空瓶中,旋紧瓶盖,然后将样品瓶置于自动进样器托盘中。分析时SPME纤维插入样品瓶的顶空部分,在250 r/min振动速率条件下50 ℃萃取40 min,再将纤维插入GC进样口,250 ℃解吸5 min,此过程在自动进样器上自动完成。
1.3.3 GC-MS测试条件
GC条件:DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.50 μm);载气为氦气,流速1.3 mL/min;进样口温度250 ℃,不分流进样;程序升温:40 ℃保持2 min,以3 ℃/min升温,250 ℃保持1 min。
MS条件:电子电离源;电子能量70 eV;GC-MS接口温度250 ℃;离子源温度200 ℃;质量扫描范围29~500 u。被测组分定性采用全扫描模式,NIST 2014标准谱库检索。定量采用选择离子监控模式。
1.3.4 感官品评
选取8 位有经验的啤酒品评专家组成品评小组,参照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[25]将样品置于12 ℃恒温水浴中,并对77 例啤酒样品进行感官品评。将品评结果分为4 类:爽口性最差的啤酒为1 分,爽口性最佳的啤酒为4 分,并与GC-MS检测数据进行归一化处理,得到相关化学信息的关系矩阵。
本研究对某啤酒生产企业于2017年在国内11 个不同生产厂生产的不同原麦汁浓度的啤酒进行取样,共77 例样品按爽口性品评结果分为4 类,GC-MS检测数据为自变量,将这些数据导入SIMCA-P 14.1进行PLSDA。数据分析采用软件MS Workstation 8.0、Microsoft Excel、SIMCA-P 14.1。分析方法过程如下:建立训练集样本分类变量;对分类变量和数据进行PLS-DA,建立类别判别回归模型;根据所建立模型计算测试集的分类变量值Yp,Yp>0.5、偏差<0.5,判定属于该类;Yp<0.5、偏差<0.5,判定不属于该类;偏差≥0.5,判别不稳定。
在收集的77 例样本中随机选取其中50 例为训练集,其余27 例为测试集。现将50 例样本作为训练集导入SIMCA-P 14.1软件进行PLS-DA,如表1、2所示。
表1 校准集样品信息
Table 1 Information about the calibration set of samples
样品编号生产厂代码生产日期质量浓度/(mg/L) 爽口性得分原麦汁 癸酸 癸酸乙酯 辛酸 辛酸乙酯 异戊醇 香叶烯 乙酸苯乙酯1 ER 2017/7/24 8 2.48 0.03 2.87 0.11 37.19 0.11 0.08 3 2 NN 2017/7/25 8 1.29 0.02 2.13 0.06 37.66 0.09 0.06 3 3 SJ 2017/8/1 8 2.79 0.03 2.43 0.11 37.83 0.12 0.05 3 4 BJ 2017/7/26 8 2.26 0.04 2.50 0.10 35.98 0.10 0.06 3 5 BJ 2017/8/19 8 1.97 0.02 1.56 0.10 32.60 0.04 0.05 4 6 BJ 2017/7/17 8 0.80 0.02 1.22 0.10 30.99 0.04 0.03 4 7 BJ 2017/5/19 8 1.98 0.03 1.55 0.10 33.42 0.02 0.04 4 8 SJ 2017/5/18 8 2.17 0.03 2.05 0.16 36.39 0.15 0.05 3 9 NN 2017/5/19 8 1.30 0.01 1.49 0.09 37.43 0.08 0.04 3 10 SJ 2017/7/28 8 2.84 0.04 2.21 0.16 37.19 0.10 0.06 3 11 SZ 2017/8/22 8 1.87 0.02 1.41 0.11 39.28 0.06 0.04 3 12 SJ 2017/8/24 8 1.12 0.02 1.31 0.12 38.82 0.06 0.04 3 13 ER 2017/9/20 8 1.52 0.02 1.49 0.13 36.80 0.06 0.05 3 14 CD 2017/7/20 8 0.81 0.01 1.32 0.09 36.46 0.08 0.05 3 15 CD 2017/8/20 8 1.84 0.02 1.39 0.11 38.02 0.03 0.04 3 16 CD 2017/6/4 8 1.84 0.02 1.18 0.08 36.77 0.03 0.04 3 17 NN 2017/10/21 8 1.04 0.01 1.05 0.06 37.15 0.02 0.02 3 18 CD 2017/10/15 8 1.30 0.01 0.92 0.10 38.70 0.03 0.02 3 19 PD 2017/9/16 8 1.69 0.01 2.94 0.08 36.92 0.08 0.03 3 20 SZ 2017/7/23 9 1.17 0.02 1.07 0.06 38.58 0.05 0.03 3 21 SZ 2017/10/23 8 1.13 0.04 1.81 0.09 38.27 0.05 0.04 3 22 SJ 2017/9/23 8 1.32 0.04 2.42 0.11 36.36 0.03 0.04 3 23 SJ 2017/10/16 8 1.29 0.04 1.71 0.15 36.88 0.10 0.04 3 24 BJ 2017/7/26 8 2.30 0.03 1.95 0.15 34.78 0.08 0.05 4 25 NN 2017/8/18 8 0.85 0.01 1.30 0.08 33.84 0.03 0.03 4 26 SZ 2017/5/19 8 0.76 0.01 1.09 0.07 33.94 0.03 0.04 4 27 BJ 2017/9/11 8 1.74 0.03 1.15 0.10 33.73 0.02 0.04 4 28 SZ 2017/9/19 8 0.81 0.01 0.73 0.07 34.80 0.05 0.03 4 29 CD 2017/9/20 8 0.93 0.01 0.87 0.08 33.67 0.03 0.04 4 30 ER 2017/8/22 8 0.83 0.01 1.03 0.08 36.10 0.03 0.03 3 31 BJ 2017/10/16 8 1.01 0.02 1.03 0.09 34.24 0.02 0.03 4 32 SZ 2017/9/21 8 1.14 0.02 0.53 0.06 35.03 0.02 0.02 4 33 ER 2017/10/20 8 1.51 0.04 1.67 0.15 35.46 0.05 0.04 4 34 PJC 2017/6/19 10 1.07 0.01 1.79 0.11 50.65 0.06 0.05 2 35 PJC 2017/7/7 10 1.81 0.01 1.82 0.10 49.54 0.06 0.04 2 36 PJC 2017/6/16 10 0.97 0.01 1.81 0.09 49.99 0.06 0.05 2 37 PJC 2017/7/4 10 0.59 0.01 1.50 0.10 52.34 0.07 0.05 2 38 KY 2017/2/11 10.5 1.52 0.03 2.14 0.07 54.38 0.09 0.08 2 39 KY 2017/6/2 10.5 2.02 0.01 2.35 0.01 50.44 0.03 0.05 2 40 KY 2015/12/31 10.5 1.50 0.01 2.29 0.03 61.40 0.04 0.07 1 41 KY 2017/6/7 10.5 1.68 0.03 2.25 0.07 58.12 0.16 0.07 1 42 KY 2016/12/22 10.5 1.35 0.04 2.05 0.09 61.32 0.17 0.08 1 43 SZ 2017/8/2 8 2.35 0.05 2.01 0.10 42.63 0.06 0.06 3 44 CD 2017/7/20 8 1.12 0.02 1.92 0.09 39.71 0.06 0.07 3 45 JY 2017/6/15 10 0.97 0.01 1.95 0.09 43.26 0.11 0.04 3 46 ZH 2017/6/12 10 0.52 0.01 1.68 0.11 44.01 0.05 0.03 3 47 KY 2017/6/3 10.5 1.36 0.03 1.93 0.07 45.17 1.16 0.04 3 48 SZ 2017/8/2 8 2.26 0.04 1.58 0.14 43.22 0.07 0.05 3 49 NN 2017/6/22 8 0.96 0.01 1.16 0.07 41.10 0.04 0.03 3 50 SJ 2017/8/22 10 1.14 0.02 1.01 0.11 41.81 0.03 0.03 3
表2 测试集样品信息
Table 2 Information about the test set of samples
样品编号生产厂代码 生产日期 质量浓度/(mg/L) 爽口性得分原麦汁 癸酸 癸酸乙酯 辛酸 辛酸乙酯 异戊醇 香叶烯 乙酸苯乙酯51 ZR 2017/2/4 11.2 1.37 0.06 0.55 0.25 44.56 0.04 0.07 3 52 ZH 2017/9/11 10 0.42 0.01 1.58 0.11 51.30 0.09 0.06 2 53 PD 2017/10/9 10 2.37 0.04 1.99 0.13 51.68 0.00 0.09 2 54 PD 2017/10/22 10 0.98 0.01 1.08 0.11 58.64 0.28 0.11 1 55 PJC 2017/10/8 10 1.39 0.02 1.63 0.12 51.38 0.05 0.09 2 56 SJZ 2017/8/2 8 2.05 0.03 2.35 0.11 43.51 0.04 0.04 3 57 XZ 2017/9/4 8 1.87 0.01 0.96 0.09 48.77 0.02 0.05 2 58 SS 2017/10/14 8 2.17 0.03 2.17 0.11 43.10 0.03 0.07 3 59 NN 2017/10/10 8 2.01 0.02 2.02 0.12 41.04 0.03 0.05 3 60 ZZ 2017/9/21 8 2.11 0.01 2.00 0.10 40.71 0.02 0.04 3 61 FZ 2017/10/16 8 1.97 0.02 1.92 0.09 37.74 0.02 0.04 3 62 SJ 2017/8/1 8 1.94 0.05 1.05 0.10 40.48 0.01 0.05 3 63 PD 2017/10/15 8 1.49 0.02 2.02 0.06 48.20 0.02 0.08 2 64 ZH 2017/9/24 8 1.85 0.01 1.12 0.07 38.78 0.02 0.04 3 65 TY 2017/9/1 8 1.76 0.01 0.18 0.08 43.70 0.03 0.08 3 66 NK 2017/8/3 8 1.69 0.02 0.41 0.08 43.87 0.03 0.06 3 67 CZ 2017/8/10 10 1.20 0.02 0.31 0.15 39.57 0.00 0.11 3 68 ER 2017/9/3 8 1.49 0.02 0.70 0.09 35.58 0.03 0.05 4 69 HEB 2017/8/26 8 1.12 0.01 0.71 0.08 39.42 0.02 0.09 3 70 HZ 2017/8/8 9 1.58 0.06 1.55 0.15 42.79 0.09 0.05 3 71 BJ 2017/7/24 8 0.89 0.02 0.68 0.06 32.69 0.05 0.04 4 72 CS 2017/8/25 8 1.31 0.03 1.37 0.06 32.58 0.03 0.03 4 73 HZ 2017/10/31 10 1.97 0.03 1.50 0.08 33.09 0.00 0.04 4 74 JN 2017/8/17 8 0.52 0.01 0.71 0.04 40.09 0.02 0.04 3 75 MAS 2017/7/26 8 1.24 0.01 0.82 0.08 28.75 0.03 0.03 4 76 LS 2017/9/2 8 0.87 0.01 1.39 0.05 32.16 0.00 0.05 4 77 YZ 2017/8/26 8 1.16 0.03 1.45 0.08 30.82 0.02 0.03 4
图1 主成分分析得分图(A)和PLS-DA得分图(B)
Fig. 1 Score plots of principal component analysis (A) and PLS-DA (B)
在PLS-DA前先进行主成分分析,如图1A所示,前3 个主成分对应特征值累计贡献率为77.9%,可表征相关风味成分的大部分信息。从图1A可直观判断不同样品组间区分还不够明显,存在重叠现象;但多数样本在95%的置信区间内,说明搜集的样本本身质量稳定、分布均匀、模型稳健,且实验操作过程也没有引入较大误差。因此,这些数据可用于进一步的PSL-DA。如图1B所示,由于同时使用了X变量与Class分组变量,因此使组间差异明显改善,较主成分分析能够更好区分不同组间的样本。
由于PLS-DA通过对变量空间的投影旋转找出类别判别的潜在变量,可有效避免主成分分析中代表样本类别的方向与方差最大方向不一致的情况。按照样本类别特征赋予训练集样本分类变量值。本研究根据实际品评结果,人工设置样本分类变量组,然后利用PLS-DA回归分析方法对训练集样本的7 种爽口性关键风味组分与品评得分进行回归分析,并建立PLS-DA回归模型。
将50 个样本按品评结果分为4 组数据集作为建模的训练集,其PLS-DA回归曲线图的相关系数分别为0.861、0.798、0.765、0.812,样品辨别率为92%,说明模型的拟合较好,具有较高的可靠性,可用于判别未知啤酒样品的爽口性。
图2 PLS-DA载荷图
Fig. 2 Loading plot of PLS-DA
如图2所示,DA(1)、DA(2)、DA(3)、DA(4)分别表示4 组类别变量Y在载荷图中的位置,Y附近的X变量对此类别有更高的辨别能力。图中显示辛酸乙酯、癸酸乙酯及乙酸异戊酯等酯类化合物为DA(1)与DA(2)的特征敏感特征变量;而DA(3)的敏感特征变量为辛酸、癸酸与香叶烯。
SIMCA-P采用置换检验对PLS-DA模型进行验证。利用样本数据的随机排列进行统计推断[26]。它通过对样本进行顺序上的置换,重新计算统计检验量,构造经验分布,然后在此基础上求出P值进行推断。Y的顺序被随机地重复200 次,并且分离的模型被拟合到所有置换的Y中,提取与原始矩阵Y一样多的分量。
图3 PLS-DA模型置换验证图
Fig. 3 Permutation validation of the PLS-DA model
Q2为累计交叉有效性,其值越大表示模型的预测能力越好;R2为累计方差值,表示有多少原始数据被用来建立新的PLS-DA判别模型,其值大则表示模型的解释能力强。由图3可以看出,左侧的R2和Q2值均低于最右边的R2和Q2值,且Q2回归线的截距均为负值,说明所构建的4 个PLS-DA判别模型均没有出现过拟合的现象,且都有较好预测能力,都能用于各自类别的判别分析。
27 个样本作为验证集,使用已建立的PLS-DA模型进行判别。如表3所示,不同啤酒样品的爽口性预测均方根误差在0.183~0.523之间,未知样品的预测识别率为74.07%,说明所建立的PLS-DA模型能很好地预测和评价未知样品爽口性。
表3 PLS-DA判别模型分析结果
Table 3 Analysis results with the PLS-DA model
爽口性得分 指标 1# 2# 3# 4#校准集R2 0.861 0.798 0.765 0.812校准集均方根误差 0.179 0.280 0.473 0.363判别率 92%(46/50)测试集 预测均方根误差 0.183 0.321 0.523 0.323预测率 74.07%(20/27)
目前PLS-DA建模方法非常成熟,已应用到啤酒分析的各个方面[27],其方法简单、快捷,解释能力强。本研究采用HS-SPME-GC-MS技术结合PLS-DA建立相应的数学模型并对啤酒爽口性进行判别,其结果能够很好地判别啤酒爽口性的程度。通过外部测试集验证,该模型具有较强的预测能力,校正集均方根误差与预测均方根误差参数均具有较好的预测精度,可满足判断不同啤酒样品爽口性的需求。
由于影响啤酒口感的因素众多,除本实验涉及的几种风味物质外,成品酒中的离子及蛋白[28]的组成,丙三醇、残糖[29]和苦味物质[30]的含量分布及饮用时的酒体温度[31]等因素均会不同程度地影响啤酒爽口性,因此要更加准确地判别啤酒爽口性,进一步提高模型的准确性及精度,还需在更大范围内建立相应的数学模型。
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