图1 特级郫县豆瓣酱的3D色谱图
Fig. 1 3D chromatogram of volatile fl avor compounds in special grade Pixian bean paste
郫县豆瓣酱俗称郫县豆瓣，距今已有300多年的历史。它以二荆条红辣椒、青皮蚕豆、小麦粉为主要原料，通过微生物制曲、前发酵，再经过翻、晒、露等后发酵工艺酿制而成[1-2]，其制作技艺已经列入国家级非物质文化遗产名录[3]。郫县豆瓣具有色泽红褐油润、瓣粒香脆、味鲜辣及酱酯香等特点，是川菜食谱中最经典的调味品之一，被誉为“川菜之魂”。
由于郫县豆瓣风味独特，对其风味成分的研究受到学者们广泛关注。例如罗静等[4]采用气相色谱-质谱法测定不同后发酵期郫县豆瓣样品中挥发性呈香物质，共检测出9 个类别超过140 种挥发性呈香物质。刘平等[5]采用气相色谱-嗅觉测量法及香气活性值法对郫县豆瓣中的特征香气物质进行鉴定，共检测出112 种挥发性物质。随着研究的不断深入，传统的气相色谱及气相色谱-质谱法在风味成分研究上的局限性也逐渐暴露出来，主要存在分离度低、峰容量有限、检测成分较少等缺陷。全二维气相色谱-飞行时间质谱（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF MS）是将两根不同极性固定相的色谱柱以串联方式连接在一起，进行正交分离。所检测的成分首先通过第1维色谱柱分离后，经调制器聚焦，然后以脉冲方式进入第2维色谱柱进行二次分离[6-8]。因而GC×GC-TOF MS具有高分离度、高分辨率、高灵敏度和高峰容量等优点，对食品复杂组分分离鉴定具有显著的优势。目前GC×GC-TOF MS已成功应用于茶[9-10]、香醋[11-12]、白酒[13-14]、豆酱[15]等发酵食品研究。前人对于郫县豆瓣的风味成分研究集中在酯类、醇类等挥发性香气成分，对于非挥发性成分研究尚鲜见报道。因而，本研究拟采用柱前衍生化法，结合GC×GC-TOF MS技术鉴定郫县豆瓣的风味物质，为阐明其风味物质基础、质量标准提升及工艺优化等提供科学依据。
3 批不同特级豆瓣酱样品购买于四川省成都市郫都区超市，生产日期分别为2016年5月、2016年8月和2016年12月。豆瓣酱经冷冻干燥后，粉碎过100 目筛，备用。
异丙醇、乙腈（均为色谱纯） 德国C N W Technologies公司；吡啶（色谱纯） 上海Adamas公司；甲氧铵盐（分析纯） 日本TCI公司；核糖醇（纯度≥99%） 美国Sigma公司；衍生化试剂：双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含有1%三甲基氯硅烷） 美国REGIS Technologies公司。
手动75 µm CAR/PDMS固相微萃取头 美国Supelco科技公司；GC×GC-TOF MS系统、7890B GC仪、DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm）色谱柱、DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.1 μm）色谱柱 美国安捷伦科技公司；PEGASUS 4D TOF MS 美国力可公司；Heraeus Fresco17型离心机、Forma 900 series型超低温冰箱美国Thermo Fisher Scientific公司；BSA124S-CW型分析天平 德国Sartorius公司；JXFSTPRP-24型研磨仪上海净信科技有限公司；TNG-T98型真空干燥仪 太仓市华美生化仪器厂；PS-60AL型超声仪 深圳市雷德邦电子有限公司；DHG-9023A型烘箱 上海一恒科学仪器有限公司。
1.3.1 液液萃取方法提取
参照Kind等[16]的方法稍作修改。准确称取粉末样品100 mg于2 mL EP管中，加入1 mL提取液（异丙醇-乙腈-超纯水体积比3∶2∶2），再加入20 μL核糖醇，涡旋30 s。加入磁珠，45 Hz研磨仪处理4 min，超声10 min（冰水浴），然后4 ℃、12 000 r/min离心8 min。移取0.8 mL上清液于2 mL进样瓶（甲烷硅基化）中，在真空浓缩器中干燥提取物，然后向干燥后的代谢物中加入200 μL甲氧铵盐试剂（甲氧铵盐酸盐溶于吡啶，20 mg/mL），轻轻混匀后，放入烘箱中50 ℃孵育90 min。最后向样品中加入200 μL双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺（含有1%三甲基氯硅烷），将混合物50 ℃孵育30 min，然后上机检测。所有样品均重复3 次。
1.3.2 GC条件
柱系统由两根色谱柱组成：柱1：DB-5MS（30 m×250 μm，0.25 μm），柱2：DB-17HT（1.9 m×100 μm，0.1 μm），柱子之间通过毛细管柱连接器连接。载气为氦气，流速1.0 mL/min。操作条件：升温程序从90 ℃开始，保持1 min，以5 ℃/min速率升到170 ℃，再以10 ℃/min速率升到250 ℃，最后以25 ℃/min速率升到300 ℃，保留13 min。进样口采用分流模式，进样量为1.0 μL，隔垫吹扫流速为3 mL/min。
1.3.3 MS条件
采用电子电离源，电子轰击能量为-70 eV；前进样口温度为270 ℃，传输线温度为300 ℃，离子源温度为220 ℃；质量扫描范围m/z为33～600，扫描速率为100 spectrum/s，溶剂延迟为0.3 min。
数据处理使用ChromaTOF软件对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。
郫县豆瓣风味成分十分复杂，样品需要预处理才能检测。目前前处理方法包括固相微萃取方法和液液萃取方法。其中采用固相微萃取方法检测郫县豆瓣中的挥发性香气成分已有较多文献报道。例如黄著等[17]采用固相微萃取方法提取郫县豆瓣酱的挥发性组分，经GC-MS分离鉴定出8 类共计82 种化合物；黄湛等[18]通过顶空固相微萃取方法测定7 个不同后发酵期郫县豆瓣样品，共检测出104 种挥发性风味物质；刘燕等[19]采用固相微萃取方法从干燥的郫县豆瓣样品中鉴定出44 种挥发性物质；Li Xiyang等[20]采用固相微萃取方法从传统郫县豆瓣和商业郫县豆瓣样品中分别鉴定出56 种和37 种风味物质。为更好地提取郫县豆瓣中的风味成分，本研究首先对比固相微萃取方法与液液萃取方法提取效率。固相微萃取方法能检测到856 个化合物，而液液萃取法可以检测到987 个化合物，因而，本研究采用液液萃取法提取样品。这与前人研究结果类似，例如Yao Feng等[21]以白酒为研究对象，采用固相微萃取方法鉴定得到2 178 种成分，而液液萃取方法鉴定得到2 482 种成分，表明液液萃取方法能够获得更多的风味成分。
在分离过程中，第1维柱子采用非极性柱（DB-5MS）分离，第2维柱子采用中等极性柱（DB-17HT）进行正交分离。从图1可以看出，郫县豆瓣组分极为复杂，其一维色谱图中有大量化合物存在共流出现象，通过进一步的二维色谱分离，共流出的化合物在二维色谱图中得到较好分离，有利于进一步对这些化合物进行准确定性及定量分析。本研究在特级郫县豆瓣酱样品中共分离检测到1 005 个化合物，远高于以往研究报道。
图1 特级郫县豆瓣酱的3D色谱图
Fig. 1 3D chromatogram of volatile fl avor compounds in special grade Pixian bean paste
本研究首先通过Pegasus 4D色谱分析工作站，结合Mainlib谱库、Replib谱库、NIST谱库以及Wiley谱库的自动解卷积和检索分析（选择RSN＞50的色谱峰进行分析），选择相似度大于800。从豆瓣酱样品中鉴定出218 种物质，可将鉴定出的物质分为10 类，如图2所示，分别为有机酸类、氨基酸类及其衍生物、糖类及其衍生物、醇类、胺类、酯类、酮类、酚类及其他化合物（主要包括含硫化合物、氮杂环化合物和氧杂环化合物）。由图2可知，有机酸类化合物种类最多，达到72 种，其次为氨基酸及其衍生物，为40 种。醛类化合物和酚类化合物少，分别为5 种和4 种。
图2 特级郫县豆瓣酱中物质种类分布
Fig. 2 Various classes of volatile components identified in special grade Pixian bean paste
图3 郫县豆瓣酱中物质的相对含量
Fig. 3 Relative contents of various classes of volatile compounds identified in special grade Pixian bean paste
如图3所示，有机酸类化合物在郫县豆瓣酱物质基础中的相对含量最高，占比为30.36%。其次为氨基酸及其衍生物和胺类化合物，分别为26.58%和16.48%。而酮类化合物、醛类化合物和酚类化合物在郫县豆瓣中的相对含量较少，均小于1.0%。以往郫县豆瓣挥发性成分检测结果，主要成分是醇和酯[17-20]。本研究通过衍生化技术增强了一些难以挥发成分的检测，因此能够测定到更多的风味成分。例如有机酸、糖类和氨基酸类等成分检测。结合图2和图3可知，在特级郫县豆瓣样品中，有机酸类化合物和氨基酸及其衍生物的种类和相对含量均较高，而糖类及其衍生物的种类较多但相对含量却较少，造成此现象的原因可能是特级豆瓣酱的发酵时间长，在其发酵过程中，由于蛋白酶的作用，蛋白质水解产生游离氨基酸，美拉德反应和Strecker氨基酸降解反应又会消耗所产生的游离氨基酸，同时氨基酸还可以通过脱氨作用、转氨作用、联合脱氨或脱羧作用，分解成胺类、α-酮酸等物质，这些物质可以转变成糖、脂类或再合成某些非必需氨基酸[22-23]。而糖类化合物作为微生物发酵过程的碳源和能源，不断被微生物消耗产生酸，因此糖类含量较低[24-25]。
如表2所示，有机酸类化合物是特级郫县豆瓣酱中含量最高的一类化合物，其中戊二酸和肌酸是含量最高的2 种有机酸，相对含量分别达到14.72%和6.65%。醇类化合物中D(+)-阿拉伯糖醇（1.37%）、山梨糖醇（3.11%）和肌醇（1.15%）等物质的相对含量较高。15 种胺类化合物中乙酰苯胺（11.58%）和丙二酰胺（3.23%）为主要组成物质。22 种糖类及其衍生物中，塔格糖、果糖、麦芽三糖和D-半乳糖含量相对较高。酯类化合物主要物质为十七酸甲酯（2.20%）和1-甘油-棕榈酸酯（0.50%），其余物质相对含量均较低（＜0.1%）。4 种酚类化合物、9 种酮类化合物和5 种醛类化合物的相对含量均较低（＜0.1%）。以往报道中豆瓣酱除醇类、酯类、酸类等挥发性成分外[26]，氨基酸则是豆瓣酱的主要呈味物质[27]，其中天冬氨酸和谷氨酸为鲜味氨基酸，是豆瓣酱中鲜味的主要来源[28]。然而，本实验中天冬氨酸相对含量很低（＜0.01%，未列出），谷氨酸相对含量为4.04%。其可能原因在于样品成分不完全一样，其中丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甘氨酸为甜味氨基酸[29-30]，对豆瓣酱的风味形成有利，在特级郫县豆瓣酱中的相对含量分别为2.38%、0.67%、0.50%和1.06%。
表2 郫县豆瓣酱GC×GC-TOF MS分析鉴定出的主要物质
Table 2 List of main components indenti fi ed in special grade Pixian bean paste by GC ×GC-TOF MS analysis
化合物 保留时间/min 分子式 CAS号 相对含量/%有机酸肌酸 4.300 3 C4H9N3O2 57-00-1 6.65草酸 5.378 2 C2H3NO3 471-47-6 1.63乳酸 8.989 4 C3H6O3 50-21-5 3.41戊二酸 38.967 0 C5H8O4 110-94-1 14.72酯类辛酸甲酯 7.567 3 C9H18O2 111-11-5 0.01葡萄糖酸内酯 25.800 4 C6H10O6 90-80-2 0.09棕榈油酸甲酯 25.900 6 C17H32O21120-25-8 0.01十七酸甲酯 26.067 1 C18H36O21731-92-6 2.20亚油酸甲酯 27.367 1 C19H33O2 112-63-0 0.05 1-甘油-棕榈酸酯 30.056 1 C19H38O4 542-44-9 0.50 2-甘油-棕榈酸酯 31.133 8 C19H38O423470-00-0 0.05醛类戊二醛 7.833 9 C5H8O2 111-30-8 0.01丁醛 11.233 8 C4H8O 123-72-8 0.01琥珀半醛 11.833 9 C4H6O3 692-29-5 0.01正辛醛 28.234 1 C8H16O 124-13-0 0.01糖类及其衍生物麦芽三糖 13.833 9 C18H32O161109-28-0 0.31 3,6-脱水半乳糖 23.233 8 C6H10O514122-18-0 0.11蔗果三糖 23.889 3 C19H34O16 470-69-9 0.11 D-半乳糖 24.456 0 C6H12O6 59-23-4 0.26塔格糖 24.656 0 C6H12O6 87-81-0 0.39果糖 30.700 5 C6H12O6 57-48-7 0.35
续表2
化合物 保留时间/min 分子式 CAS号 相对含量/%氨基酸及其衍生物N-甲基-DL-丙氨酸 4.933 9 C4H9NO2600-21-5 10.11丝氨酸 16.022 7 C3H7NO3 56-45-1 0.67丙氨酸 16.100 5 C3H7NO2 56-41-7 2.38苏氨酸 16.633 8 C4H9NO3 72-19-5 0.50酮类1,3-环己二酮 7.111 7 C6H8O2 504-02-9 0.03 1,3-二羟基丙酮 7.356 0 C3H6O3 96-26-4 0.09 2-甲氧基雌素酮 7.756 0 C19H24O3 362-08-3 0.02 1-茚酮 10.622 7 C9H8O 83-33-0 0.02 1,4-环己二酮 14.078 3 C6H8O2 637-88-7 0.03酚类愈创木酚 11.967 3 C8H8FN 90-05-1 0.01邻苯二酚 15.100 6 C6H6O2 120-80-9 0.01 α-生育酚 36.767 6 C29H50O2 59-02-9 0.01醇类苯甲醇 3.767 0 C7H8O 100-51-6 0.23 1,4-二硫代赤藓醇 6.189 3 C4H10O2S26892-68-8 0.17 D(+)-阿拉伯糖醇 22.811 5 C5H12O5 488-82-4 1.37山梨糖醇 25.400 4 C6H14O6 50-70-4 3.11肌醇 26.833 7 C6H12O6 87-89-8 1.15 3,3′-氧基二-1,2-丙二醇 31.433 9 C6H14O5 627-82-7 0.12胺类乙酰苯胺 3.933 7 C8H9NO 103-84-4 11.58丙二酰胺 5.678 2 C3H6N2O2108-13-4 3.23 L-天冬酰胺 22.100 5 C4H8N2O3 70-47-3 0.08 1,4-丁二胺 23.167 1 C4H12N2 110-60-1 0.04 3-吲哚乙酰胺 29.489 4 C10H10N2O 879-37-8 0.03其他1-甲基乙内酰脲 5.889 4 C4H6N2O2616-04-6 0.05尿嘧啶 15.500 6 C4H4N2O2 66-22-8 0.10胞嘧啶 19.822 8 C4H5N3O 71-30-7 0.03
本研究通过柱前衍生化技术，增强一些难以挥发成分的检测，因此能够检测到更多的成分。进一步采用GC×GC-TOF MS技术，实现对郫县豆瓣复杂风味成分的分离分析。定性鉴定出包括有机酸类、氨基酸及其衍生物、糖类及其衍生物、醇类、酯类、酚类、酮类、醛类、胺类及其他类化合物（主要包括含硫化合物、氮杂环化合物和氧杂环化合物）在内的10 类物质共218 种成分。研究结果为郫县豆瓣风味解析、工艺优化及质量标准提升等提供科学依据。
[1] 李幼筠. “郫县豆瓣”剖析[J]. 中国酿造, 2008, 27(6): 19-23.DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2008.06.027.
[2] 余浪, 阚建全. 传统豆瓣的研究进展[J]. 中国调味品, 2008, 33(5):26-31. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2008.05.002.
[3] 中国非物质文化遗产保护中心. 第二批国家级非物质文化遗产名录简介[M]. 北京: 文化艺术出版社, 2010: 128.
[4] 罗静, 赵红宇, 徐炜桢, 等. 郫县豆瓣后发酵过程中挥发性呈香物质测定及主成分分析[J]. 食品科学, 2018, 39(18): 209-216.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201818033.
[5] 刘平, 霍刚, 陈功, 等. 郫县豆瓣特征香气物质的研究鉴定[J]. 中国酿造, 2015, 34(1): 27-32. DOI:10.11882/j.issn.0254-5071.2015.01.007.
[6] DALLUGE J, BEENS J, BRINKMAN U A. Comprehensive twodimensional gas chromatography: a powerful and versatile analytical tool[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 1000(1/2): 69-108.DOI:10.1016/S0021-9673(03)00242-5.
[7] TRANCHIDA P Q, DUGO P, DUGO G, et al. Comprehensive two-dimensional chromatography in food analysis[J]. Journal of Chromatography A, 2004, 1054(1/2): 3-16. DOI:10.1016/j.chroma.2004.07.095.
[8] ADAHCHOUR M, BEENS J, BRINKMAN U A. Recent developments in the application of comprehensive two-dimensional gas chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2008,1186(1/2): 67-108. DOI:10.1016/j.chroma.2008.01.002.
[9] 刘顺航, 徐咏全, 李长文, 等. 普洱茶粉挥发性成分全二维气相色谱/飞行时间质谱研究[J]. 茶叶通讯, 2016, 43(3): 13-18. DOI:10.3969/J.ISSN.1009-525X.2016.03003.
[10] 程权, 杨方, 李捷, 等. 顶空固相微萃取-全二维气相色谱/飞行时间质谱法分析闽南乌龙茶中的挥发性成分及其在分类中的应用[J].色谱, 2015, 33(2): 174-181. DOI:10.3724/SP.J.1123.2014.09042.
[11] 尹俊玲. 传统手工和现代工业化生产镇江香醋风味组分的比较研究[D]. 镇江: 江苏大学, 2016: 57-66.
[12] ZHOU Z, LIU S, KONG X, et al. Elucidation of the aroma compositions of Zhenjiang aromatic vinegar using comprehensive two dimensional gas chromatography coupled to time-of-flight mass spectrometry and gas chromatography-olfactometry[J].Journal of Chromatography A, 2017, 1487: 218-226. DOI:10.1016/j.chroma.2017.01.014.
[13] 李俊, 王震, 郭晓关, 等. 基于全二维气相飞行时间质谱联用法分析贵州酱香型白酒挥发性风味成分[J]. 酿酒科技, 2016, 36(12): 102-106. DOI:10.13746/j.njkj.2016311.
[14] ZHU S, LU X, JI K, et al. Characterization of flavor compounds in Chinese liquor Moutai by comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2007, 597(2): 340-348. DOI:10.1016/j.aca.2007.07.007.
[15] LEE S Y, LEE S, LEE S, et al. Primary and secondary metabolite profiling of doenjang, a fermented soybean paste during industrial processing[J]. Food Chemistry, 2014, 165(3): 157-166. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.05.089.
[16] KIND T, WOHLGEMUTH G, LEE D Y, et al. FiehnLib-mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry[J].Analytical Chemistry, 2009, 81(24): 10038-10048. DOI:10.1021/ac9019522.
[17] 黄著, 彭熙敏, 刘超兰, 等. 郫县豆瓣挥发性香气成分剖析及其在陈酿过程中的变化研究[J]. 中国调味品, 2009, 34(3): 106-111.DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2009.03.026.
[18] 黄湛. 郫县豆瓣特征香气的鉴定及其形成规律研究[D]. 成都: 西华大学, 2016: 35-38.
[19] 刘燕, 王雪梅, 陶旋, 等. 不同干燥方法对郫县豆瓣挥发性风味成分的影响[J]. 食品与发酵工业, 2018, 44(9): 110-116. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.017195.
[20] LI X Y, ZHAO C S, ZHENG C, et al. Characteristics of microbial community and aroma compounds in traditional fermentation of Pixian broad bean paste as compared to industrial fermentation[J].International Journal of Food Properties, 2017, 20(3): 1-12. DOI:10.10 80/10942912.2017.1373358.
[21] YAO F, YI B, SHEN C, et al. Chemical analysis of the Chinese liquor Luzhoulaojiao by comprehensive two-dimensional gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 9553. DOI:10.1038/srep09553.
[22] 武俊瑞, 顾采东, 田甜, 等. 豆酱自然发酵过程中蛋白质和氨基酸的变化规律[J]. 食品科学, 2017, 38(8): 139-144. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201708022.
[23] 徐琳娜, 王璋, 许时婴. 豆瓣酱后熟过程中氨基酸和风味物质的变化[J]. 中国调味品, 2006(9): 21-25. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2006.09.004.
[24] 高秀芝, 王小芬, 李献梅, 等. 天源酱园豆酱发酵过程中营养及理化指标动态[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 352-354. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2008.09.079.
[25] 郑宇, 谢三款, 于松峰, 等. 中国传统发酵调味食品微生物功能分析与菌种选育技术[J]. 生物产业技术, 2017(1): 82-90. DOI:10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.013.
[26] REBOREDORODRIGUEZ P, GONZALEZBARREIRO C,CANCHOGRANDE B, et al. Concentrations of aroma compounds and odor activity values of odorant series in different olive cultivars and their oils[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2013, 61(22):5252-5259. DOI:10.1021/jf400804m.
[27] LIN H B, YU X Y, FANG J X, et al. Flavor compounds in Pixian broad-bean paste: non-volatile organic acids and amino acids[J].Molecules, 2018, 23(6): 1299. DOI:10.3390/molecules23061299.
[28] TSENG Y H, LEE Y L, LI R C, et al. Non-volatile fl avour components ofGanoderma tsugae[J]. Food Chemistry, 2005, 90(3): 409-415.DOI:10.1016/j.foodchem.2004.03.054.
[29] 白羽嘉, 陶永霞, 张莉, 等. 阿魏对阿魏菇氨基酸及挥发性成分的影响[J]. 食品科学, 2013, 34(14): 198-204. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201314040.
[30] 李志江, 王欣, 戴凌燕, 等. 工厂生产化条件下豆酱发酵过程的指标与品质分析[J]. 黑龙江八一农垦大学学报, 2017, 29(4): 67-71.DOI:10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.015.
Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography-Time-of-Flight Mass Spectrometry Analysis of Flavor Components in Pixian Bean Paste
LI Weili, YUAN Xu, LIU Yushu, et al. Comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry analysis of fl avor components in Pixian bean paste[J]. Food Science, 2019, 40(6): 261-265. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180330-419. http://www.spkx.net.cn