肉类含有人体所需的高质量蛋白，具有良好的风味及适口性，受到广泛青睐[1]。1961年以来，由于人口的增加，城市化、工业化、教育和收入的提高，发展中国家人均肉类消费量增长迅速，预期到2030年，肉类需求量将增加72%[2-4]。近年来，过度食用肉制品引起的公共卫生问题，生产加工过程的土地资源、水资源消耗及CO2排放等环境问题一直是人们关注的焦点，因此利用植物资源生产高蛋白仿肉制品的研究引起了人们的广泛关注[5-6]。
仿肉制品与某些肉类的美学性质和化学特性相似，其由非动物蛋白制成，口感、外观及风味类似肉类[7]。由于植物蛋白仿肉制品具有较高营养特性及生产成本较低、价格稳定、不易受季节性供应波动影响、保质期长、易贮存等加工贮藏特性，可作为昂贵动物源蛋白的替代品应用于食品加工工业中[8-10]。目前常用的仿肉制品原料为大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、脱脂豆粉、谷朊粉等，其中大豆分离蛋白及谷朊粉成分单一，常用于学术研究。谷朊粉是一种复合物，是从小麦面粉中分离出来的小麦面筋蛋白，其主要组分是麦谷蛋白和醇溶蛋白，由于其低廉的生产成本及良好的功能特性（如溶解性、黏度、膨胀性和营养品质）而广泛用于仿肉制品的生产加工中[11]。杨耸[12]和Kumar[13]等的研究结果表明向大豆分离蛋白中混入适量的谷朊粉可提高仿肉制品的纤维化程度，改善产品的口感及风味，增加产品亮度及白度。
目前主要用挤压、冻结、纺丝黏结和水蒸气膨化等方法制备仿肉制品，其中挤压法应用广泛，其可大规模连续化生产，操作便利、不产生废料、产品质地均匀[14]。而高湿挤压技术（物料水分质量分数≥40%）是国际上新兴的植物蛋白重组技术，得到的产品质地与肉类相似，不需复水即可直接食用，营养成分和生理活性成分损失少，但得到的产品风味较差，豆腥味严重，需对挤压物料进行调味，以改善产品的感官可接受度[15]。Menis等[16]探讨了低水分含量挤压条件对玉米糁挤压物结构及风味物质异戊酸、丁酸乙酯和丁酸保留率的影响，结果发现挤压参数会影响挤出物的感官可接受度，且高温高转速及低温低转速下，挤出物的感官可接受度较高。Yuliani等[17-18]分别利用酪蛋白酸钠和β-环糊精微胶囊技术包埋风味物质柠檬烯，以玉米淀粉为挤压原料进行低水分含量挤压，结果发现柠檬烯的保留率受挤压条件的影响较大，较低温度下，提高螺杆转速导致风味物质保留率下降。郑雅丹[14]、刘毅[19]的研究结果表明，适度增加螺杆转速可降低高湿挤压亚麻糊的弹性模量，提高物料在机筒中受到的摩擦力及剪切力，增加挤出物弹性、组织化度、持水率等，改变挤出物的水分分布及微观结构。上述研究表明挤压产品的挥发性风味物质保留率可能与挤压螺杆转速有关，且螺杆转速的变化可能影响挤压样品的微观结构、水分分布等结构特性[19-20]。
目前对低水分含量挤压产品风味物质保留率的研究较多，对高湿挤压产品挥发性风味物质保留率的研究尚鲜见报道。本实验利用高湿挤压技术制备植物蛋白仿肉制品，以大豆分离蛋白为主要挤压原料，天然呈味粉末油脂为香气调味料，确定螺杆转速对挤出物微观结构、水分分布、蛋白结构及挥发性风味物质保留率的影响，以期为持香型仿肉制品的生产加工提供理论依据。
大豆分离蛋白（蛋白质量分数98%） 山东禹王生态食业有限公司；谷朊粉 郑州天龙生物科技有限公司；天然呈味粉末（成分：香辛料风味提取物、β-环状糊精） 广州市晨益贸易有限公司；实验所需基础试剂均为分析纯 北京化学试剂公司。
拌粉机 济南德伦机械设备有限公司；FT-36型双螺杆挤压机 济南真诺机械有限公司；DZ型真空包装机万昌隆包装机电有限公司；7890 A-5975 C气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；CTC顶空进样针（5 mL）瑞士Hamilton公司；FD 5-series冷冻干燥机 美国SP科学公司；5570型扫描电子显微镜、8400 S傅里叶变换红外光谱仪 日本日立公司；mq 20-核磁共振分析仪德国Bruker公司；AL 204型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3.1 持香型仿肉制品的制备
拌料→参数调节→喂料→高湿挤压→真空密封→冷藏
准确称取1 kg大豆分离蛋白于拌粉机中，加入大豆分离蛋白质量10%的谷朊粉和1%（占大豆分离蛋白和谷朊粉总质量的百分比）的天然呈味粉末，在拌粉机中混合20 min，混合的同时于注水口添加60%（占总物料质量的百分比）的去离子水；调节挤压机喂料速率30 g/min，螺杆转速分别为200、250、300、350 r/min，挤压筒各加热区段温度：1区（喂料区）为20 ℃，2～5区（加热区）依次为80、100、120、150 ℃，6区和7区为冷却段，监控温度为60～80 ℃；将拌好的物料分批加入喂料桶，进行挤压，挤出样品立即密封并于4 ℃冰箱储存备用[10]。
1.3.2 顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析
参照叶韬等[21]的研究方法，萃取头于气相色谱仪进样口活化1 h（270 ℃），分别精确称取2.0 g切割为2 mm左右的样品及挤压原料于自动进样瓶中，加入1 μL的2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）标准品，密封，插入自动顶空进样器，调节温度为90 ℃，解吸3 min。色谱条件：色谱柱DB-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），柱流量1 mL/min，进口温度250 ℃，调节起始温度为40 ℃，停留2 min；升温速率6 ℃/min，升至120 ℃，停留5 min；升温速率8 ℃/min，升至200 ℃，停留2 min；升温速率10 ℃/min，升至250 ℃，停留8 min。质谱条件：接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电离方式为电子电离，电子能量70 eV，质量扫描范围45～450 amu/s。以匹配度大于80的化合物进行质谱定性，以挥发性风味物质的峰面积与TMP峰面积的比值进行定量，挤压样品中各挥发性物质保留率按下式计算。
1.3.3 扫描电子显微镜观察
参照孙志欣[22]的方法，将仿肉样品切片（厚1 mm、宽4 mm、长4 mm），用体积分数2.5%、pH 6.8的戊二醛固定（4 ℃、1.5 h），0.l mol/L pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液冲洗（2 次、10 min/次），体积分数50%、70%、90%乙醇溶液各脱水10 min，100%乙醇脱水两次（每次10 min），100%乙醇与叔丁醇混合溶液（1∶1，V/V）脱水15 min，叔丁醇脱水15 min（室温高于25 ℃下操作），冷冻干燥4 h，样品观察面向上粘于扫描电子显微镜样品台，镀金（厚度1 500 nm），将镀金后的样品放入扫描电子显微镜观察（放大倍数为500）。
1.3.4 核磁共振分析
将挤压样品切条置于直径25 mm的核磁管中（布满至核磁管高度的1/3处，尽量不留空隙），参照李腾[23]的扫描参数，用CPMG序列测量横向弛豫时间T2，各样品重复测量3 次，保存数据，记录T2b、T21和T22。
1.3.5 傅里叶变换红外光谱分析
参考和陈锋亮[15]Beck[24]等的研究方法，将真空冷冻干燥的样品粉碎，在红外灯下研磨后取样（2 mg），并混入200 mg溴化钾纯品于玛瑙研钵中，研磨约15 min后进行压片（压力14 kg、时间1 min），将样品片放入傅里叶变换红外光谱仪中扫描。扫描条件：光谱扫描范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，信号扫描累加64 次。利用分峰软件PeakFit 4.0进行图谱处理。
每组实验都进行3 次平行，并将实验数据进行误差分析。采用统计学软件SPSS 18对实验数据进行相关性（Pearson相关系数法）和显著性分析（方差分析，P＜0.05为差异显著）；采用Origin 8.5软件进行作图；数据及方差分析利用Design-Expert软件进行。
表1 螺杆转速对仿肉制品挥发性风味物质保留率的影响
Table 1 Effect of screw rotation speed on the retention rate of volatile fl avor substances in meat analogues
注：同行肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；1～4.分别表示螺杆转速为200、250、300、350 r/min的挤压样品。表2、3同。
挥发性风味物质（香味类型）挥发性风味物质保留率/%1 2 3 4 β-月桂烯（香脂香气） 44.88±2.24a 58.99±2.95b 77.33±3.86c 69.36±3.47c 1-甲基-4-异丙基-环己二烯 31.90±1.59a 35.29±1.76a 64.08±3.20b 60.74±3.04b 3-蒈烯（松木样香气） 16.05±0.80a 18.27±0.91a 94.60±4.73b 44.90±2.25b柠檬烯（柠檬香味） 29.31±1.46a 38.34±1.91b 46.48±2.32d 41.09±2.05b 1-甲基-4-丙烯基-环己烷 9.72±0.48a 18.77±0.94b 66.84±3.34c 62.12±3.11d 3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯 0.00±0.01a 1.07±0.05b 0.00±0.01a 2.87±0.14c石竹烯（淡的丁香似香味） 1.64±0.08a 3.51±0.18b 9.79±0.49c 4.30±0.22c草蒿脑（大茴香似香气） 16.33±0.81a 19.68±0.98b 47.31±2.37d 19.08±0.95b茴香脑（大茴香味） 54.00±2.70a 58.94±2.95b 91.46±4.57c 92.88±4.64c总烯类挥发性风味物质相对总保留率 22.65±1.13a 28.10±1.41b 55.32±2.77c 44.15±2.21c麦芽酚（焦奶油硬糖的香气） 16.79±0.84a 38.81±1.94b 86.50±4.33c 76.16±3.81d丁香酚（丁香香气） 0.63±0.03a 4.25±0.21b 5.59±0.28a 5.66±0.28c总酚类挥发性风味物质相对总保留率 8.71±0.44a 21.53±1.07b 46.05±2.30c 40.91±2.05d对甲氧基苯甲醛（类似山楂的气味） 9.27±0.46a 12.50±0.63b 16.97±0.85c 12.55±0.63b对异丙基苯甲醛（有枯茗和桂皮似香气） 7.59±0.38b 10.16±0.51a 9.69±0.48a 11.61±0.58b总醛类挥发性风味物质相对总保留率 8.43±0.42a 11.33±0.57b 13.33±0.67b 12.08±0.60b丙二酸二乙酯（甜的醚气味） 54.76±2.74a 67.50±3.38b 92.04±4.60b 90.07±4.50b桉树醇（像樟脑的气味） 0.00±0.01a 0.00±0.01a 0.00±0.01a 0.00±0.01a 1-甲基-4-异丙基-环己烷 31.97±1.60a 35.29±1.76a 60.23±3.01b 61.55±3.08b各挥发性风味物质相对总保留率 20.30±1.01a 24.65±0.23b 44.07±2.30d 40.58±2.03c
由表1可知，仿肉制品中各挥发性风味物质的总保留率及烯类、酚类、醛类、醇类、酯类及烷烃类的挥发性风味物质保留率随螺杆转速的增加均有先增多后减少的变化趋势，且在300 r/min时最大。上述保留率变化的原因可能与挤压过程中蛋白结构变化有关，一定程度上增加螺杆转速，导致挤压过程中蛋白对部分挥发性风味物质的吸附能力增强，在仿肉制品挤出时，受水分蒸发影响较小，导致保留率较大[19,25]；而随着螺杆转速的继续增加，物料在机筒的滞留时间缩短，与蛋白的吸附时间相应缩短，且较高的转速也可能破坏β-环状糊精胶囊，导致更多的风味物质流出，在物料挤出时，随挤出物中部分水分的蒸发而损失，导致其保留率较低[18]。不同挥发性风味物质的保留率有较大差异，保留率最高达到92.88%（茴香脑），最低为0（3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、桉树醇），而与其他类型相比，醇类及醛类的保留率相对较小，原因可能与风味物质的物理化学特性有关，挤压过程中蛋白与其结合，检测过程中风味无法释放，导致保留率较小[26]。其中3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯、桉树醇的保留率较小（最低为0%），原因可能是原料中这两种挥发性风味物质含量较少，且在挤压过程中损失严重，导致剩余含量较少而难以检测到。
图1 螺杆转速对仿肉制品显微结构（纵截面）的影响
Fig. 1 Effect of screw rotation speed on the longitudinal microstructure of meat analogues
图2 螺杆转速对仿肉制品显微结构（横截面）的影响
Fig. 2 Effect of screw speed on the cross-sectional microstructure of meat analogues
由图1、2可知，螺杆转速对仿肉制品的微观结构影响较大，200～250 r/min时，仿肉制品的微观结构较紧密，增加至300 r/min时，仿肉制品内部出现断裂现象，继续增加螺杆转速，仿肉制品内部出现空洞。上述微观结构的变化可能与物料在挤压过程中化学键变化及蛋白二级结构变化有关，螺杆转速增加，增强了螺杆对物料的剪切力及物料与机筒的摩擦力，蛋白在挤压过程中变性程度增加，黏性降低，在高强度剪切力下，内部出现断裂现象[20]，且转速过高，物料在挤出时部分膨化，产生管状气腔结构[14,27]，出现图1d和图2d中的空洞。
图3 不同螺杆转速的仿肉制品T2弛豫曲线
Fig. 3T2 relaxation time distribution curves of meat analogues at different screw rotation speeds
表2 螺杆转速对仿肉制品T2的影响
Table 2 Effect of screw rotation speed onT2 relaxation time of meat analogues
指标 1 2 3 4 T2b/ms 0.54±0.03b 0.58±0.05c 0.54±0.03b 0.51±0.03a T21/ms 4.24±0.20a 4.76±0.30b 4.41±0.35b 4.24±0.20a T22/ms 43.63±1.06a 43.63±1.06a 48.93±1.17b 48.93±1.17b
由图3及表2可知，随螺杆转速的增加，仿肉制品T2b先增大后减小，250 r/min时，T2b最大。由Bosmans[28]和Li Teng[29]等的研究结果可知，弛豫时间短于1 ms的组分主要为蛋白质等大分子物质中不可交换的CH质子，其埋藏于分子内部，较难接触外部水分子，自由度较低；而上述结果变化的原因可能是螺杆转速的提高，增加了挤压物料的混合速度，促进热量传递并形成较多摩擦热，导致蛋白在挤压过程中变性严重，损失部分CH质子，减弱蛋白内部与水分子间的相互作用，导致T2b增大[20]。而继续增加螺杆转速，较高的剪切力可能促进水分进入蛋白内部，增强蛋白与水分子间的相互作用，水分子运动自由度降低，导致T2b减小[23,30]。
由表2中T21的变化趋势可知，随螺杆转速的增加，T21有先增大后减小的变化趋势，且250 r/min时，其仿肉制品T21有最大值4.76 ms。由Ruan等[30]的研究结果可知，T21对应水分在仿肉制品中大分子间转移和水分子与蛋白大分子间氢键变化的弛豫时间，结合上述结果说明，一定程度上加快螺杆转速可增加水分子的运动性，原因可能是螺杆转速增加，蛋白变性程度增强，内部疏水基团较亲水基团暴露更多，疏水作用较强（可能影响部分挥发性风味物质的吸附[19]），导致水分子间的相互作用较蛋白与水分子间的强烈，水分转移更自由，T21增大；而继续加快螺杆转速，亲水基团暴露较多，蛋白与水分子间形成氢键，导致水分转移较困难，T21减小[14,24]。
由表2中T22的变化趋势可知，螺杆转速由200 r/min增加到250 r/min时，T22不变；由250 r/min增加到300 r/min时，T22增大，且继续增加螺杆转速，T22不变。推测T22对应的主要为仿肉制品内部较大空隙及裂缝中的水分子运动弛豫时间，该部分水分子运动自由度高，对应T22值较大[24]。结合2.2节显微结构分析可知，螺杆转速增加300 r/min，物料在挤出时受到的剪切强度增大，仿肉制品内部出现断裂及膨化现象，T22对应水分转移较自由，导致T22增大。
由图4可知，与挤压原料相比，仿肉制品在3 300～3 500 cm-1范围O—H及N—H键的伸缩振动吸收总体减弱，但随着螺杆转速的增加变化不规律，其中在300 r/min时的振动吸收最强，且比原料的振动吸收强，说明蛋白质与水分子的O-H基团、氨基酸的C＝O基团之间分子内、分子间氢键较强，推测该结果与部分亲水基团形成氢键有关[25,31]。而与挤压原料相比，仿肉制品在2 200～2 400 cm-1范围伸缩振动吸收增强，且随着螺杆转速的增加，振动吸收先增强后减弱，其中在250 r/min的振动吸收最强，该部分主要是—CH2变形振动及C—H键伸缩振动，其吸收峰强度的变化可能与氢键的形成及蛋白与某些风味成分的结合有关[32]。1 600～1 700 cm-1范围称为酰胺I带，由该波长范围通过PeakFit 4.0软件进行基线校正、去卷积、二阶导数拟合[33]，得到各二级结构相对含量（表2）。其中β1为β-反向平行折叠片层，由分子间强相互作用氢键维持；β2由分子间非平面弱氢键维持；β-折叠及α-螺旋由分子内相互作用氢键维持；β-转角为松散有序结构，含量最高；γ-无规卷曲由C＝O与水形成的氢键维持[34-35]。
图4 不同螺杆转速仿肉制品的红外光谱图
Fig. 4 Infrared spectra of meat analogues at different screw rotation speeds
表3 不同螺杆转速仿肉制品蛋白质二级结构的相对含量
Table 3 Relative percentage of protein secondary structures in meat analogues at different screw rotation speeds
注：β1.β-反向平行折叠片层；β2.由分子间平面弱氢键维持（偶极子转换相互作用）；/.波数不连续。
二级结构各构象相对含量/%β1 β2 β-折叠α-螺旋β-转角γ-无规卷曲样品α-螺旋+β-折叠β1+β2波数/cm-1 1 608～1 622 1 682～1 700 1 622～1 637 1 646～1 662 1 662～1 681 1 637～1 645 / /挤压原料 8.44d 11.64c 25.06a 14.69b 25.89b 14.27a 39.75a 20.08d 1 7.82c 10.62b 26.86b 16.79c 24.10a 14.81a 43.65b 18.44c 2 8.01c 12.49c 25.49a 15.59b 24.21a 15.20a 41.08a 20.50d 3 7.14b 10.31a 25.41b 14.90a 26.23b 16.01b 40.31a 17.45b 4 6.22a 10.20a 26.81b 15.13a 27.14c 15.70a 41.94a 16.42a
由表3可知，仿肉制品主要由松散有序结构（β-转角，相对含量约25%）与紧密有序结构（α-螺旋+β-折叠，40%左右）组成，α-螺旋+β-折叠相对含量较β1+β2高，说明仿肉制品分子内氢键相互作用较强[34]。随螺杆转速的增加，仿肉制品中β1和β2相对含量先增加后减少，各挤压处理组β1相对较挤压原料少，其中在250 r/min时，β1和β2相对含量最高，且β2较挤压原料相对含量高；由刘燕琪等[34]的研究表明β1由分子间亲水侧链强氢键维持，其相对含量较高，可能蛋白亲水基团含量较多，蛋白亲水水合作用较强，β2由分子间非平面弱氢键维持，上述结果说明在一定程度上增加螺杆转速，可增加仿肉制品的分子间弱氢键含量。β1+β2二级结构相对含量主要表征蛋白分子间氢键作用，由表3可知，β1+β2相对含量随螺杆转速的增加先增加后减少，且在250 r/min时含量最高，表明在该转速下，仿肉制品中分子间氢键作用最强，蛋白聚集增多，导致蛋白结构更为紧密，可能利于对部分挥发性风味物质的保持[26]。β-转角的相对含量随螺杆转速的增加而增多，α-螺旋+β-折叠相对含量呈先减少后增多的变化趋势，且在300 r/min时的相对含量最少，说明在一定程度上螺杆转速的增加，可减少仿肉制品中紧密有序结构的含量，增加松散有序结构，有利于蛋白在挤压过程中的结构变化，易于形成纤维状仿肉制品及部分挥发性风味物质的吸附[19,36]。γ-无规卷曲相对含量随螺杆转速的增加有先增多后减少的变化趋势，且在300 r/min时最多，可能与β1、β2向γ-无规卷曲结构转变有关，说明在一定程度上增加螺杆转速，C＝O与水分子的氢键作用增强，进而影响T2b的变化趋势；且由王辰等[37]的研究可知γ-无规卷曲含量与表面疏水性呈正相关，说明在一定程度上增加螺杆转速，可能引起挤压过程中部分疏水基团暴露，增强疏水相互作用及疏水水合作用，可能导致挤压过程中蛋白对风味物质的吸附力增强，继而提高挥发性风味物质的保留率[36]。
本实验研究了螺杆转速对持香型大豆分离蛋白仿肉制品微观结构、水分分布、挥发性风味物质保留率的影响。结果表明一定程度上增加螺杆转速，可产生较为紧密的仿肉制品微观结构，减弱水分子的运动自由度，减少α-螺旋和β-折叠紧密结构的相对含量，使蛋白二级结构展开，上述结构变化有利于挥发性风味物质的保持，原因可能是紧密的仿肉制品结构导致风味物质扩散速度减慢；水分子运动自由度减弱可侧面反映风味物质的扩散速率，其自由度低，风味扩散较慢；另外二级结构的展开（柔性增加）、蛋白氢键及疏水基团的增多可能促进部分风味物质与蛋白发生可逆性结合，在顶空气相色谱-质谱分析过程中升温导致这部分风味物质释放，造成风味物质保留量增多。
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