氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）又称尿烷、乌来糖、乌来坦、乌拉坦，分子式为C3H7NO2，是烟草叶及香烟的天然成分，也是发酵食品（如面包、乳酪、酸奶等）和酒精饮料（如葡萄酒、日本清酒和中国黄酒等）在发酵或贮存过程中天然的伴随产物[1-2]。
EC具有口服毒性，同时具有多位点致癌性，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌和皮肤癌等疾病[3]。1993年，我国曾建立了检测出口酒中EC的标准方法[4]，但目前并未对国内葡萄酒中EC含量进行标准限定。对国内外葡萄酒中EC含量的检测结果表明，有30.6%的葡萄酒超出联合国粮食及农业组织20 μg/L的标准，这给消费者健康及葡萄酒行业的持续发展带来了潜在的威胁。当前对于EC的研究大都集中在中国黄酒[5-8]，而针对葡萄酒的研究相对较少[9-11]。本文参考发酵饮品和食品的相关研究，分析总结EC危害、国际限量标准、葡萄酒中含量变化、形成机制、影响因素及控制方法，以期为提高我国葡萄酒安全性提供科学依据和参考。
EC具有口服毒性、多位点致癌性、免疫功能抑制作用和心率抑制作用[12-14]。在生物体内EC主要有3 条代谢途径：一是水解作用，包括N的羟基化、C的羟基化以及支链的氧化，EC主要被肝脏中的微粒酯酶水解形成乙醇、氨和二氧化碳[15]，对于啮齿类动物，大约5%的EC随尿液和粪便排泄出体外，超过90%的EC被水解；二是侧链氧化作用，约0.5%的EC被细胞色素P450氧化为乙烯基-氨基甲酸酯，随后形成环氧乙烯基甲酸甲酯，这种环氧化物在体内可与DNA形成加聚物，造成DNA双链结构损伤，从而导致细胞癌变[16]；三是比较普遍的羟基化作用，约0.1%的EC被细胞色素P450氧化为N-羟基-EC，同时生成过氧化氮，前者能够导致Cu2+调控的DNA碱基突变，造成氧化损伤[17]。其中，第二、三条代谢途径具有致癌作用。
E C的急性口服毒性低，当单次剂量达到1 000 mg/kgmb时可麻醉啮齿类动物，长期摄入EC会导致实验小鼠体质量和存活率下降及肿瘤的发生[18]。人们食用的EC质量浓度超过30 μg/L后，患癌几率增加[19]。在正常饮食习惯下（不含发酵酒精饮料），EC的日摄入量为10～20 ng/kgmb，如果葡萄酒中的EC含量超标，长期超量饮用葡萄酒（500 mL/d）会使癌症风险增加5 倍[20]。目前EC的致癌性在小鼠、大鼠、仓鼠、猴子中已经被证实[21]，一定剂量的EC可以增加啮齿类动物肺、肝、副泪腺、心脏（雌雄）、乳腺、卵巢、皮肤和前胃（雄性）的患癌几率；其中肺部最易受到感染[14,22]，雌雄小鼠每日摄入300 µg/kgmb EC，肺泡和支气管肿瘤发病率为10%[1]。按照2.5×105 µg/kgmb的EC剂量饲喂猪43 d，其微核网织红细胞发生率增加3.3 倍[23]。用100 mmol/L EC处理人肝癌细胞，EC以时间依赖性的方式影响细胞代谢和转录，主要通过脂肪酸氧化（可能也是精胺分解途径）和醛累积（由于解毒能力降低）而引起氧化应激和细胞死亡，从而导致能量消耗、能量降低、膜完整性破坏、DNA和蛋白质损伤[24]。此外，动物实验表明，EC能显著抑制抗体反应，降低胸腺质量。因此，EC对正常小鼠免疫功能也具有一定的抑制作用[13]。
EC对蟾蜍在体心脏心率影响的研究表明，EC可能影响了心肌细胞蛋白质的合成，进而影响心肌细胞跨膜离子通透性，使窦房结P细胞的自动去极化速率减慢，延长到达阈值的时间，导致心率减缓[12]。
Barron等[25]的研究表明，葡萄酒能够有效地抑制人肺癌细胞的增殖与存活，主要表现为抑制苏氨酸蛋白激酶（protein kinase B，Akt）信号通路和细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）的存活途径，诱导抗肿瘤物质p53的生成。与白葡萄酒相比，红葡萄酒显示出更强的抗肿瘤活性。另有实验表明，当小鼠同时摄入含有相同EC含量的葡萄酒与水时，摄入葡萄酒小鼠的突变率下降，这表明葡萄酒中的其他成分可以拮抗EC的影响[26]。
EC普遍存在于多种传统发酵食品（如馒头、腐乳、果酒、果醋、发酵茶等）中[27]，人体摄入EC绝大部分是通过饮用酒精饮料，其中，葡萄酒是重要来源之一。2002年联合国粮食及农业组织确定EC为重点监控物质，并制定了国际标准，规定葡萄酒中其质量浓度不得超过20 μg/L。2007年，世界卫生组织国际癌症机构将EC由2B类致癌物（或可能令人患癌的物质）正式归为2A类致癌物（可能令人患癌的物质），并限制了其使用范围[1]。联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会规定，EC基准剂量可信下限值为每天300 µg/kgmb，食物中EC的平均摄入量约为每天15×10-3 µg/kgmb[15]，对于酒精饮料的EC建议日均摄入量不超过8×10-2 µg/kgmb[28]。目前，欧盟没有统一的EC最高限量标准[1]，世界上不同国家和组织对酒精饮料中EC的质量浓度标准也存在差异（表1）。
表1 不同国家和组织对酒精饮料中EC质量浓度的限定标准
Table 1 Maximum residue limits for ethyl carbamate in alcoholic beverages
注：—.目前为止没有规定。
国家及组织葡萄酒EC质量浓度/（μg/L）加强葡萄酒EC质量浓度/（μg/L）蒸馏酒EC质量浓度/（μg/L）清酒EC质量浓度/（μg/L）水果白兰地EC质量浓度/（μg/L）参考文献联合国粮食及农业组织 20 — — — — [29]加拿大 30 100 150 200 400 [1,10]美国 15 60 — — —[1,10,30]捷克共和国 30 100 150 200 400 [1]法国 — — 150 — 1 000[1]德国 — — — — 800[1]瑞士 — — — — 1 000[15]巴西 — — 150 — —[31]日本 30 100 150 100 400 [15,32]韩国 30 — — — —[33]
分析我国市场上2 2 6 种葡萄酒样品中E C的质量浓度，结果表明，E C质量浓度范围在1.16～46.00 μg/L[34-36]，其中符合20 μg/L联合国粮食及农业组织标准的葡萄酒占69.4%，符合美国EC限量15 μg/L的葡萄酒仅占28.8%[36-37]，且干红葡萄酒EC平均质量浓度（14.03 μg/L）＞干白葡萄酒（9.22 μg/L）＞起泡葡萄酒（6.12 μg/L）[36]。
新酿造的葡萄酒中EC质量浓度一般在1～10 μg/L。在‘丹魄’红葡萄酒中使用16 种微生物进行工业规模的自然苹果酸-乳酸发酵后，样品中EC最低质量浓度从0.85 μg/L升高至0.93 μg/L，最高质量浓度从4.23 μg/L升高至4.70 μg/L，平均质量浓度从2.03 μg/L上升至2.21 μg/L，上升了8.65%，但是方差分析结果表明差异不显著[38]。随着陈酿时间的延长，其含量有增加趋势。将葡萄酒样品放置在75 ℃的恒温烘箱48 h来加速EC形成，由此产生的浓度称为EC潜在浓度。实验证明，此浓度与葡萄酒在30 ℃条件下贮存两年后的EC浓度一致，且在酒精度为10%的模拟酒中，苹果酸-乳酸发酵后酒中的瓜氨酸浓度与EC潜在浓度呈线性相关[39-40]。因此，在装瓶或陈酿前监测EC潜在浓度，可以估计陈酿后葡萄酒中EC的含量。
通过外加反应底物（瓜氨酸、尿素）的方法，研究葡萄酒中EC的变化发现，贮存期间葡萄酒中EC含量呈现先快速增加（约前30 d），随后缓慢增长的趋势[41]。在18 ℃下贮存一年，红葡萄酒中EC质量浓度从2 μg/L上升到4.5 μg/L，白葡萄酒中EC质量浓度从检测下限上升到4.2 μg/L；在23 ℃下贮存一年，红葡萄酒中EC质量浓度从2 μg/L上升到6.5 μg/L，白葡萄酒中EC质量浓度从检测下限上升到6.2 μg/L[42]。
葡萄酒酿造过程中，EC的形成有5 条途径，即尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、氰化物、3a,6a-二甲基甘脲（3a,6a-dimethylglycoluril，DMGU）与乙醇反应形成EC[20,43]。尿素和瓜氨酸与乙醇的反应是EC的主要形成途径[20,39,44]。在这两条主要的形成途径中，因为尿素浓度常高于瓜氨酸浓度，且瓜氨酸的醇解反应速率较低，EC主要来源于尿素形成途径[10]。
在葡萄酒中，EC前体物质的来源有多种途径。葡萄生长过程中，施用氮肥使果实中尿素含量增加；发酵过程中，酵母菌通过尿素循环途径，代谢底物中过量的精氨酸产生尿素[45-46]，并释放到发酵液中，使酒中尿素含量升高[47]。瓜氨酸主要来自酿酒酵母细胞内的尿素循环途径和乳酸菌中的精氨酸脱亚氨基酶代谢途径[48-49]。酿造过程中，酵母降解精氨酸生成尿素和鸟氨酸，鸟氨酸在鸟氨酸氨甲酰转移酶的作用下，生成瓜氨酸[45]；苹果酸乳酸发酵过程中，乳酸菌代谢精氨酸也会分泌瓜氨酸[47]。酵母和乳酸菌代谢精氨酸代谢产生的瓜氨酸部分与乙醇直接反应生成EC，部分在鸟氨酸氨基甲酰转移酶的作用下生成氨甲酰磷酸和鸟氨酸，氨甲酰磷酸与乙醇进一步生成EC（图1）[45]。葡萄酒中EC前体物质氰化物有两种来源，一是葡萄籽中的氰苷水解形成氰化物，由铜离子催化，氧化形成氰酸盐，氰酸盐与乙醇反应生成EC（图1）[20,50]；二是在白兰地的蒸馏过程中，高温使部分尿素分解成氰酸，氰酸与乙醇反应生成EC（图1）。双乙酰和尿素反应生成DMGU，DMGU与乙醇反应生成EC（图1）[45]。
图1 EC前体物质与乙醇的反应
Fig. 1 Reaction routes of EC precursors with ethanol
影响葡萄酒中EC含量的因素是原料状况和工艺，原料状况的影响包括：生态条件（温度、降水、极端气候）[51]、葡萄品种[10,37,52]、葡萄成熟度[9]及产区[10]；工艺的影响包括发酵条件和陈酿条件，其中发酵条件包括：酒种[36,38]、pH值[14,53-57]、EC前体物质浓度[46,58]和乙醇体积分数[53-54]等。
实验表明，采用技术成熟前（19 °Brix）、理想成熟度（21 °Brix）及过熟（23 °Brix）的葡萄分别浸渍10 d，葡萄酒中EC质量浓度分别为23.6、66、96 μg/L[9]，由此可见，葡萄成熟度与葡萄酒中EC质量浓度呈正相关。
发酵过程中，发酵温度、浸渍时间、葡萄汁营养剂添加、酵母种类、乳酸菌种类及EC前体物质浓度是影响葡萄酒中EC含量的重要因素。发酵温度可以影响EC的形成速度，发酵后期升温会加快EC的形成[43]。实验表明，浸渍时间通过影响EC前体物质的浓度影响EC含量，使用理想成熟度（21 °Brix）的葡萄浸渍10 d EC质量浓度为66 μg/L，继续浸渍至20 d以上时EC质量浓度为76.3 μg/L，浸渍30 d EC质量浓度可达89 μg/L[9]。
尿素、瓜氨酸、精氨酸作为EC重要的前体物质，在葡萄汁中的含量影响着发酵结束后葡萄酒中EC的含量[19]。研究表明，葡萄汁中尿素、瓜氨酸、精氨酸含量与EC生成量均呈线性关系[59-60]。在葡萄汁发酵前分别添加尿素、瓜氨酸，二者含量在发酵过程中均呈下降趋势，但EC含量不断增加，尿素的减少主要发生在酒精发酵过程中，且尿素代谢调控方式与参与的调节剂有关[58]，而瓜氨酸的减少主要发生在苹果酸-乳酸发酵过程中。葡萄酒生产过程中，精氨酸含量先上升后下降，EC含量呈明显上升趋势。精氨酸含量上升可能是由于酵母自溶，含量下降可能是由于乳酸菌代谢精氨酸产生瓜氨酸，使EC含量上升。
因酵母生长繁殖的需要，发酵时加入氮源（如磷酸氢二铵）能明显加快发酵速率，防止发酵“阻滞”[59,61]。但添加过量的磷酸氢二铵会导致尿素的形成，尿素是EC重要的前体物质，并且部分酵母菌株对磷酸氢二铵的加入时间敏感，这也会影响EC的生成量[10,45]。酿酒酵母代谢精氨酸以及分泌尿素具有菌株特异性，car1基因通过编码精氨酸酶影响发酵液中精氨酸的含量[10,62]，调控精氨酸脱亚胺途径arc基因的表达量也可以影响精氨酸的代谢率[54,63]。葡萄汁中的精氨酸可在酵母菌内代谢产生过量的尿素，从而导致葡萄酒中尿素含量升高[47]。苹果酸-乳酸发酵阶段，乳酸菌通过精氨酸脱亚氨途径代谢产生瓜氨酸，瓜氨酸是EC另一重要前体物质，不同种类的乳酸菌代谢精氨酸能力不同，生成EC前体物质的浓度不同，导致EC的产量有较明显差异，实验表明短乳杆菌较戊糖片球菌能够积累更多氨基酸，产生更多EC[41,54,64]。
研究发现，刚酿造的新酒中，仅仅满足高尿素含量时，EC并不能大量产生[53,65]。贮存条件会影响葡萄酒中EC的最终浓度，如贮藏温度、通氧量及是否带酒脚陈酿[66-67]。贮存期间，随着温度的升高，葡萄酒中EC含量增加[15]，贮存30 d后，30 ℃下的葡萄酒样品中EC含量约为15 ℃时的1.5～2.0 倍[11]。如果葡萄酒在陈酿期间处于通风状态，尿素则大部分被降解，积累减少，导致EC含量较少。带酒脚陈酿过程中，由于酵母自溶，EC的前体物质含氮化合物、氨基酸会逐渐释放到酒中，EC含量也因此有所增加[10,55,68]。但有报道称，氨基酸含量低的葡萄所酿造葡萄酒即使延长与酒脚接触时间，也没有其他EC前体物释放[59]。
目前，EC的抑制途径大致分为4 类：选用优良菌株、改良发酵原料、优化发酵和陈酿条件以及外源添加酸性脲酶。酸性脲酶可以催化尿素分解形成氨和二氧化碳，尿素是EC重要的前体物质，因此一定条件下，向发酵完全的酒中添加酸性脲酶，尿素的分解能降低葡萄酒中的总酚和EC其他前体物质的浓度，从而达到控制EC含量的目的[39]。该方法不改变酿酒的酵母菌株及工艺条件，能够在保证原酒风味特征的前提下，有效降低葡萄酒中的EC含量，同时操作简便有效，具有良好的应用前景。自1999年起，欧洲已获准从发酵乳酸菌中提取的酸性脲酶在葡萄酒中应用[39]。但目前，我国的脲酶生产尚未产业化，主要依靠进口，这增加了生产成本及工艺复杂性[69]。而且由于脲酶是一类以镍作为辅基的金属酶，镍残留会严重影响葡萄酒安全性[70]。除此之外，通过添加尿素吸附材料、EC降解酶、EC吸附剂等途径去除酒中EC的研究越来越多，但目前此类研究都集中在黄酒[5-6,8]。
选育产尿素能力及精氨酸酶活力低的酵母菌株进行发酵，可以有效降低葡萄酒中的EC含量。此方法主要通过两条途径实现：一是增强参与尿素降解及转运相关酶的编码基因；二是沉默或敲除精氨酸酶编码基因[54,62-63]。有研究表明，工业酿酒酵母经转基因后可以将‘霞多丽’葡萄酒中EC的产量降低近90%[71]。
对发酵原料的优化主要体现在调整葡萄园管理措施上。葡萄的施肥、修剪、灌溉及地面覆盖等对葡萄汁中精氨酸浓度有很大影响[72]。因此，合理调整葡萄园管理措施，对葡萄原料进行优化，能够在一定程度上控制葡萄酒中EC的含量[46]，目前鲜见具体改良方法的研究。
葡萄酒的发酵和陈酿条件在一定程度上影响了EC的形成。发酵及贮存的温度越高，EC的生成量就越多[59]，当EC质量浓度不超过15 μg/L时，低温贮藏可限制EC质量浓度的增加[11]；pH值不同，EC的浓度差异不大[19]，但EC的形成由酸催化，因此，低pH值下EC形成速度稍快[11]；缺乏对苹果酸-乳酸发酵过程的控制，会导致EC的形成[64]；陈酿方式的不同，也会影响EC的生成，微氧且避免带酒脚陈酿的方式能够一定程度上降低其浓度。因此，合理的控制发酵、贮藏温度、pH值、陈酿方式等能够有效控制葡萄酒中EC的含量。由于酿造条件的改变可能会导致葡萄酒品质、风味、稳定性等方面的变化，采用此法时需综合考虑葡萄酒质量，尽可能地减少葡萄酒中EC的含量[46]。
消费者对于食品安全及健康越来越关注，EC作为一种广泛存在于发酵食品中的潜在有害物质，在我国还没有相关限量标准。葡萄酒作为三大最受欢迎的酒精饮料（葡萄酒、啤酒、黄酒）之一[73]，在我国市场上仍有部分产品的EC含量超出联合国粮食及农业组织标准，这对消费者的健康造成了潜在威胁。葡萄酒中EC的主要形成途径是尿素及瓜氨酸与乙醇的反应；影响EC含量的因素有原料状况和工艺；控制消除手段主要包括选用优良菌株、改良发酵原料、优化发酵和陈酿条件，以及外源添加酸性脲酶，具体优化条件仍需进一步研究。加强对葡萄酒中EC的研究，制定我国葡萄酒中EC的限量标准，通过技术手段控制EC含量，为消费者提供安全健康的葡萄酒产品，对规范葡萄酒行业生产秩序、保护我国葡萄酒消费者的健康及促进葡萄酒行业的持续发展意义重大。
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Ethyl Carbamate in Wine: A Review
李运奎（1985—）（ORCID: 0000-0001-5570-584X），男，讲师，博士，研究方向为食品营养风味与安全。E-mail: ykli@nwsuaf.edu.cn
韩富亮（1979—）（ORCID: 0000-0001-9422-4432），男，副教授，博士，研究方向为食品营养风味与安全。E-mail: hanf l@nwsuaf.edu.cn
LIU Yang, LI Yunkui, HAN Fuliang, et al. Ethyl carbamate in wine: a review[J]. Food Science, 2019, 40(7): 289-295.(in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180211-131. http://www.spkx.net.cn