汉麻籽也称火麻籽[1],其主要成分是蛋白质和脂肪,微量营养元素Ca、K、Mg、Mn等含量也较为丰富[2-3]。汉麻籽呈卵圆形微扁,因品种而不同[4]。汉麻籽仁脂肪质量分数35%~50%,蛋白质质量分数20%~40%,膳食纤维质量分数10%~40%[5-6]。汉麻籽油作为食品和天然保健用品的原料,具有活血通润的效果[7-8],对于免疫系统具有很好的药理作用[9]。用于食品开发的汉麻籽中Δ9-四氢大麻酚含量通常低于10 μg/g(以种子计)[10-11]。
目前,汉麻籽油的提取方法主要有溶剂萃取法、热榨法及冷榨法、超声辅助提取法等[12-14],这些方法虽然技术成熟,利于工业化生产,但存在不容忽视的问题[15-16]。溶剂萃取法提取油脂会造成一定的溶剂残留,需要在较高温度下才能脱除。热榨法需要在高温下进行预处理调质,高温下进行压榨[17]。汉麻籽油中有80%以上的多不饱和脂肪酸,高温易导致汉麻油过氧化值升高,很多天然营养成分被破坏,不但降低了原有的生物活性,而且降低了生物利用度[18-19]。低温冷榨制油法属于压榨法的一种,是指油料作物在入榨前不经过蒸炒等高温处理,入榨温度较低的榨油方法[20-21]。低温冷榨法制得油脂的天然成分、营养物质的流失少,避免了热榨法高温处理带来的不利影响[22-23]。在较低温度下对汉麻籽进行压榨提取油脂,最大限度地保持了汉麻籽油的天然组分和结构[24-25],但出油效率较低,资源利用度不高。
本研究在国内外大量相关文献的基础上,以汉麻籽仁为原料,在低温条件下进行初榨,得到部分功能性较好的初榨油,由于初榨温度较低,饼中残油较高,因此尝试在初榨饼中加入Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L碱性蛋白酶进行酶解,再进行低温复榨,榨取初榨饼中剩余部分油脂,以获得更高的出油效率,同时期望汉麻籽油理化指标稳定,油中功能性成分仍保留完全,为研究酶解低温榨取汉麻籽油提供一定的理论依据。
汉麻籽(脂肪质量分数40.2%,蛋白质质量分数30.6%,纤维素质量分数15.7%) 黑河市格润公司;Viscozyme L植物水解酶、Protex 6L碱性蛋白酶 诺维信生物技术有限公司;大麻酚溶液(1 mg/mL)、生育酚(纯度≥97%,1 000 IU/g) 美国Sigma公司;磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS) 中国试剂网;所有实验用有机溶剂均为国产分析纯。
SG30-2B型螺旋榨油机 肇庆市鼎湖景日晟机械有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 金坛市双捷实验仪器厂;PHS-25C数字酸度计 上海大浦仪器有限公司;N24120型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;SX-520-A10-G50-M型芯式过滤器 上海萨尔设备有限公司;RV10型旋转蒸发仪 上海圣科仪器设备有限公司;SU-8010场发射扫描电子显微镜、ES-2030型冷冻干燥仪、E-1010型离子溅射镀膜仪 日本Hitachi公司。
1.3.1 工艺流程
称取一定量的汉麻籽仁,水分调节至4%,榨膛温度50 ℃,压力3.5 MPa,计量低温初榨毛油,测定初榨饼中含油质量。将初榨饼粉碎,过60 目筛,为使其在低温条件下出油,加入3.0% Viscozyme L植物水解酶进行酶解,用PBS调节至pH 4.8,恒定温度50 ℃,保持时间4.5 h后,加入纤维素酶破坏汉麻籽中的纤维,再加Protex 6L碱性蛋白酶充分混合,使其破坏油脂与蛋白的结合,用PBS调节至pH 8.0进行酶解,在压力3.5 MPa、温度50 ℃条件下进行压榨。本实验以出油效率为指标,研究加酶量、pH值、时间、温度对酶解的影响,并对汉麻籽油基本理化指标和功能性成分进行分析。
1.3.2 Protex 6L碱性蛋白酶酶解初榨饼单因素试验
研究汉麻籽油在酶解低温压榨工艺中酶解参数的优化,根据预实验选择加酶量、pH值、时间和温度4 个因素对初榨饼酶解低温压榨进行单因素试验。选择酶解工艺优化的条件分别为:碱性蛋白酶加酶量1.2%、pH 10.5、时间3 h、温度50 ℃。在榨膛压力3.5 MPa条件下,研究碱性蛋白酶加酶量分别为0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6% 时对出油效率的影响;研究酶解pH值分别为9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5时对出油效率的影响;研究酶解时间分别为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h时对出油效率的影响;研究酶解温度分别为30、40、50、60、70 ℃时对出油效率的影响。
1.3.3 响应面优化试验
在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken设计[26],以加酶量(A)、pH值(B)、酶解时间(C)、酶解温度(D)为优化条件,以出油效率(R)为响应值设计4因素3水平响应面试验,因素与水平设计见表1。
表 1 响应面试验设计因素与水平
Table 1 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design
水平 因素A加酶量/% B pH C酶解时间/hD酶解温度/℃-1 0.8 9.5 2.0 45 0 1.0 10.0 2.5 50 1 1.2 10.5 3.0 55
1.3.4 冷榨饼扫描电镜样品制备与观察
将低温初榨饼和酶解低温复榨饼分别切成2.0 mm×3.0 mm条形,加入2.5%、pH 6.8戊二醛油状液体,并置于4 ℃冰箱中固定1.5 h。取出样品后用0.1 mol/L、pH 6.8的PBS冲洗3 次,每次10 min。再分别用体积分数为50%、70%、90%的乙醇溶液进行脱水各1 次,每次12 min;无水乙醇脱水2 次,每次12 min。置换方法采用无水乙醇-叔丁醇(体积比1∶1)和叔丁醇各1 次,每次15 min。然后将样品放入-20 ℃的冰箱中冷冻30 min,取出后再进行冷冻干燥4 h。镀金膜厚度100~150 Å。
1.3.5 指标测定
各指标测定分别参照GB 5009.236—2016《动植物油脂水分及挥发物的测定》、GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》、GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》、GB/T 14488.1—2008《植物油料 含油量测定》、GB 5009.82—2016《食品中维生素A、D、E的测定》。
汉麻籽油植物大麻素测定参照Citti等[27]的方法。
所有测定重复3 次,实验数据均以±s表示,数据采用Origin 9.0与Design-Expert 8.0.6进行分析和绘制。用SPSS 19.0进行ANOVA单因素方差分析,并采用Duncan法检验数据的差异显著性(P<0.05,差异显著)。
经过低温初榨后,测得初榨饼的残油率为21.6%。
2.2.1 加酶量对出油效率的影响
图 1 加酶量对出油效率的影响
Fig. 1 Effect of enzyme amount on oil yield
从图1可以看出,随着碱性蛋白酶的增加,出油效率随之上升,当碱性蛋白酶增加量过大时,出油效率反而下降。当碱性蛋白酶的使用量为1.0%,出油效率达到最大值,这是因为在一定范围内随着加酶量的增加,有更多的酶分子和底物相互作用,从而增加出油效率,但是当加酶量过大时,底物逐渐被酶所饱和,剩余的酶分子没有底物可以利用,同时酶的活性中心会被其他过量的酶所覆盖,影响酶解效率[28],使得出油效率不再增加而趋于平稳,所以本实验选取加酶量1.0%作为后续研究参数。
2.2.2 酶解pH值对出油效率的影响
图 2 pH值对出油效率的影响
Fig. 2 Effect of pH on oil yield
从图2可以看出,pH值在9.0~10.0,出油效率呈现上升趋势,在pH值到达10.0时,出油效率达到最大,当pH值大于10.0时,出油效率呈现下降趋势,这是因为酶对反应体系的pH值有一定的敏感性,pH值可以改变酶分子的空间构象,并影响酶分子与底物之间的结合,当pH值为10.0时,可使酶的活性位点外露,增加酶活力,使得出油效率达到最高。所以本实验选取pH 10.0作为后续研究参数。
2.2.3 酶解时间对出油效率的影响
图 3 酶解时间对出油效率的影响
Fig. 3 Effect of hydrolysis time on oil yield
从图3可以看出,在酶解时间1.5~2.5 h的范围内,随着酶解时间延长,出油效率呈现上升趋势,酶解2.5 h时出油效率达到最大值,随后趋于平稳,这是因为随着酶解时间的延长,酶分子与底物可以充分接触,进行酶解反应。但是,随着酶解时间的延长大多数底物已经被酶解,致使其出油效率增加缓慢,从生产效率上讲,时间延长会使生产效率降低[29]。所以本实验选最适酶解2.5 h作为后续研究参数。
2.2.4 酶解温度对出油效率的影响
图 4 酶解温度对出油效率的影响
Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on oil yield
从图4可以看出,出油效率呈现上升后下降的趋势,当酶解温度小于50 ℃时,出油效率随着酶解温度的升高而逐渐增加,当酶解温度超过50 ℃后出油效率明显下降。这主要是因为酶解温度升高可以使反应体系中分子运动速率上升,提升了底物和酶的接触几率,加速酶解反应进程;但是酶解温度过高会使维持酶分子结构的次级键断裂,使其部分失活,从而降低了酶活性,延缓了酶解进程,使得出油效率下降,所以本实验选取酶解温度为50 ℃作为后续研究参数[30]。
表 2 响应面设计方案及结果
Table 2 Box-Benhnken design with experiment results for response surface analysis
试验号 A加酶量 B pH值 C酶解时间 D酶解温度 R出油效率/%1 0 -1 0 -1 55 2 1 -1 0 0 60 3 0 0 1 -1 58 4 0 0 -1 -1 55 5 1 0 -1 0 56 6 0 1 0 1 61 7 -1 0 1 0 57 8 0 0 0 0 64 9 1 0 0 1 63 10 0 1 0 -1 59 11 0 1 -1 0 58 12 0 -1 -1 0 56 13 -1 1 0 0 57 14 0 0 0 0 63 15 1 0 1 0 63 16 -1 0 -1 0 55 17 1 0 0 -1 58 18 0 0 0 0 64 19 -1 0 0 1 57 20 0 0 0 0 63 21 0 1 1 0 61 22 -1 -1 0 0 57 23 -1 0 0 -1 55 24 1 1 0 0 62 25 0 -1 1 0 60 26 0 0 -1 1 57 27 0 0 1 1 63 28 0 0 0 0 64 29 0 -1 0 1 61
响应面试验设计方案及结果见表2,利用Design-Expert 8.0.6软件对结果进行方差分析,将数据进行多元回归拟合,得到出油效率(R)与加酶量、pH值、时间、温度的二次响应面回归方程为:
R=63.6+2.00A+0.75B+2.08C+1.83D+0.50AB+1.25AC+0.75AD-0.25BC-1.00BD+0.75CD-2.80A2-1.92B2-2.93C2-2.55D2
利用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行方差分析,结果见表3。
表 3 方差分析结果
Table 3 Analysis of variance
注:*.差异显著(P<0.05);**.差异极显著(P<0.01)。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 275.544 3 14 19.681 73 83.922 11 <0.000 1 **A加酶量 48 1 48 204.670 1 <0.000 1 **B pH值 6.75 1 6.75 28.781 73 <0.000 1 **C酶解时间 52.083 33 1 52.083 33 222.081 2 <0.000 1 **D酶解温度 40.333 33 1 40.333 33 171.979 7 <0.000 1 **AB 1 1 1 4.263 959 0.058 0 AC 6.25 1 6.25 26.649 75 0.000 1 **AD 2.25 1 2.25 9.593 909 0.007 9 **BC 0.25 1 0.25 1.065 99 0.319 4 BD 4 1 4 17.055 84 0.001 0 **CD 2.25 1 2.25 9.593 909 0.007 9 **A2 50.854 05 1 50.854 05 216.839 6 <0.000 1 **B2 24.036 49 1 24.036 49 102.490 6 <0.000 1 **C2 55.495 95 1 55.495 95 236.632 5 <0.000 1 **D2 42.178 38 1 42.178 38 179.846 9 <0.000 1 **回归 3.283 333 14 0.234 524失拟项 2.083 333 10 0.208 333 0.694 444 0.709 2 不显著纯误差 1.2 4 0.3总回归 278.827 6 28
由表3可知,回归方程的因变量与自变量之间存在的线性关系明显,整体模型的P值小于0.000 1,模型极显著,失拟项P值为0.709 2,失拟项不显著,表明该模型选择正确,模型中的调整系数R2Adj为97.64%,说明97.64%的响应值变化可以通过模型进行解释,相关系数R2为98.82%,表明该模型与试验拟合良好,可以用此模型进行分析和预测。
图 5 酶解参数交互作用对汉麻籽出油效率的影响
Fig. 5 Response surface plots showing the effect of interaction between hydrolysis parameters on oil yield
从图5可以看出,4 个变量在两两交互时,保持其中2个变量不变,随着另外2 个变量的增加,出油效率呈现先上升的趋势,当达到一定值时又呈现出下降趋势。其中随着AC、BD、AD、CD交互作用为极显著,BC和AB不显著,通过优化得到汉麻籽仁初次冷榨饼酶解过程的最佳工艺参数为加酶量1.11%、pH 10.05、时间2.77 h,温度52.50 ℃,该条件下出油效率预测值为65.20%。根据实际情况将工艺参数进行整理,得出整理值为加酶量1.1%、pH 10.0、酶解时间2.8 h、酶解温度52 ℃。在此条件下进行3 次平行验证实验,该条件下出油效率平均值为65.0%。实测值与预测值之间具有良好的拟合性,从而证实了模型的有效性。
由图6A可见,汉麻籽仁经过低温初榨后,微观组织结构在榨膛机械力作用下发生了一定的变形和破裂,为酶制剂渗透及酶解创造了有利条件。低温初榨饼经过Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L碱性蛋白酶酶解后(图6B),细胞壁受到水解性破坏,细胞内部分油体及蛋白体外露,图中可见,低变性蛋白体发生结构性破坏,油体蛋白脱离油体磷脂单分子膜,导致油体开放性崩解,油脂明显聚集溢出,为酶解低温复榨创造了有利条件。
表 4 汉麻籽油基本理化指标分析
Table 4 Physicochemical properties of hemp seed oils
指标 低温复榨 酶解低温复榨水分质量分数/% 0.15±0.05 0.16±0.02酸价(KOH计)/(mg/g) 3.20±0.04 3.04±0.08过氧化值/(mmol/kg) 0.78±0.01 0.77±0.01
表4数据显示,酶解低温复榨汉麻籽油的理化特征指标与低温复榨(对照组)比较,均无显著性差异(P>0.05),结果表明,酶解低温复榨工艺方法对汉麻籽油基本理化指标没有明显的影响。
表 5 汉麻籽油功能性成分分析
Table 5 Analysis of functional components of hemp seed oils
成分 低温复榨 酶解低温复榨植物大麻素/(mg/kg) 124.56±0.07 130.89±0.05生育酚/(mg/kg) 698.27±0.06 715.18±0.03
从表5可以看出,低温复榨汉麻籽油中植物大麻素含量为124.56 mg/kg,酶解低温复榨汉麻籽油中植物大麻素含量为130.89 mg/kg,无显著性差异(P>0.05)。酶解低温复榨与对照组比较植物大麻素的含量略有提高,表明酶解低温复榨工艺方法有利于植物大麻素向油相的迁移。
低温复榨汉麻籽油中生育酚的含量为698.27 mg/kg,酶解低温复榨汉麻籽油中生育酚含量为715.18 mg/kg,无显著性差异(P>0.05)。分析认为,Viscozyme L植物水解酶的预酶解导致汉麻籽细胞壁水解,生育酚与多糖的络合作用减弱,从而增强了向油相的迁移,释放出更多的生育酚。
在响应面试验优化条件下,对残油率为21.6%的汉麻籽仁低温初榨饼进行酶解低温复榨,获得的出油效率为65.0%;经过Viscozyme L植物水解酶和Protex 6L碱性蛋白酶酶解后,扫描电镜观察到初榨饼粉细胞壁破坏和油脂溢出聚集明显,这种状态有利于提高压榨过程中油脂的流动性;酶解低温复榨汉麻籽油的基本理化指标与对照组比较无显著性差异(P>0.05),植物大麻素及生育酚含量增加。酶解低温榨取汉麻籽油,借助Viscozyme L植物水解酶破坏初榨饼粉的细胞壁纤维网络,暴露其内部的蛋白体与油体蛋白,利用Protex 6L碱性蛋白酶降解蛋白,释放油脂,通过低温压榨制取汉麻籽油,该工艺方法具有出油效率高、理化指标稳定、功能性成分对油相的分配增强等优点,可以替代常规低温压榨或低温复榨提取汉麻籽油的方法。
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spkx1002-6630-20180516-240. http://www.spkx.net.cn WANG Wen, WANG Ruizhi, WANG Tong, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of cold-pressed hemp seed cake for increased oil yield by response surface methodology[J]. Food Science, 2019, 40(8): 242-247. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180516-240. http://www.spkx.net.cn