图 1 高光谱系统结构示意图
Fig. 1 Schematic diagram of hyperspectral imaging system
鸡蛋液富含人体所需的优良蛋白质和丰富的氨基酸、矿物质、维生素等营养物质，深受消费者喜爱[1-3]。作为一种有机生命体，鸡蛋易受外界不良环境影响，发生腐败变质，甚至失去食用价值[4]。研究表明，微生物是鸡蛋液发生腐败变质的主要原因，当微生物侵入鸡蛋后，菌体会经历短暂适应期，随后迅速分解鸡蛋中的营养物质供自身生长繁殖，并积累有害物质，进而使鸡蛋液发生腐败变质[5]。
对腐败鸡蛋内容物进行病源微生物分离和鉴定可以发现，假单胞菌属是优势菌属，其中铜绿假单胞菌（又称绿脓杆菌）参与鸡蛋腐败过程[6-8]。铜绿假单胞菌作为肉源腐败的优势菌种，具有来源范围广、耐药性强等特点，可分解肉中的氨基酸产生硫化物等有害次级代谢产物，并进一步加速肉的腐败进程[9-12]。而鸡蛋液作为优质蛋白质的丰富来源，是理想的微生物培养基，因此对鸡蛋液中腐败微生物进行预测对保障鸡蛋品质安全具有重要意义。通常，食品中菌落总数的测定一般参照国标[13]采用平板菌落计数，在经过样品预处理后，进行体外培养24～48 h后统计形成的菌落数量。该方法虽然精度高，但存在合适梯度稀释、时效性差、操作复杂等局限性[14-15]，因此开发快速的微生物污染程度分析方法，对维护蛋品安全和消费者健康具有重要意义。
高光谱技术在结合传统的成像和光谱学基础上，可以获得系列波长下的光谱和空间信息，具有多波段、高分别率和图谱合一的特点[16-17]。目前，利用高光谱技术在微生物快速检测方面已有部分报道。Tao Feifei等[18]利用近红外高光谱技术对牛肉表面菌落总数进行预测，证明无损方法对菌落数量预测的可行性；Feng Yaoze等[19]利用近红外高光谱技术对鸡肉中肠杆菌科微生物的污染进行定量预测；Cheng Junhu等[20]利用可见/近红外高光谱技术建立支持向量机（support vector machine，SVM）模型对鱼肉中细菌总数进行快速预测；He Hongju等[21]研究证明近红外高光谱技术可以有效预测大马哈鱼中乳酸菌含量；Barbin等[22]采用近红外高光谱技术预测猪肉在储存过程中细菌总数和嗜冷菌的数量，结果表明菌数量与光谱值存在较高的相关性；Foca等[23]通过接种的方法利用高光谱对干切火腿表面乳酸菌进行预测，结果证明菌数量与光谱强度存在相关性，高光谱成像技术不仅能对菌的数量进行预测亦能对菌的种类进行判别。诸多研究表明，微生物感染后造成的样品光谱特性的差异，可用于开发微生物污染的快速检测技术。因此，本实验拟通过收集不同程度腐败鸡蛋液的光谱特性和菌落信息，结合多元统计分析方法，为实现高光谱技术对鸡蛋液中菌落总数的定量分析提供参考。
样本为南京六合养鸡场提供的“海兰”粉壳鸡蛋，挑选大小形状均一的新鲜鸡蛋140 枚。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），分离自牛奶中，在4 ℃条件下贮藏。
平板计数琼脂（PCA）培养基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 L，pH 7.0±0.2；液体培养基配方：蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏3.0 g，氯化钠5.0 g，水1 L，pH 7.3±0.1。
高光谱图像检测系统：ImSpectorV 10E成像光谱仪芬兰Specim公司；ICL-B1620 CCD摄像机 美国Imperx公司；3900ER可调谐光源 美国Illumination Technologies公司；IRCP0076视觉平台 台湾Isuzu公司；配有图像采集软件的计算机 台湾五铃光学股份有限公司；恒温恒湿箱 宁波赛福实验仪器有限公司；紫外超净台 苏州苏净安泰有限公司；振荡培养箱常州国华电器有限公司。
1.3.1 菌种的活化及接种
将铜绿假单胞菌转接至液体培养基中，于35 ℃、180 r/min条件下振荡培养18 h后转接至新的液体培养基中，继续振荡培养8 h后，梯度稀释至104 CFU/mL。
将鸡蛋打开存放于直径为12 cm的无菌培养皿中，考虑到新鲜壳蛋最大接菌量，故污染组鸡蛋液在蛋清中接入0.5 mL的铜绿假单胞菌菌悬液。处理后将鸡蛋液样本存放于20 ℃、相对湿度50%的恒温恒湿箱中培养，每天取8 个污染组蛋液样本，6 个对照组蛋液样本进行实验，共计10 d。以无菌生理盐水作为对照，分别统计每个蛋液不同组分（蛋清、蛋黄和全蛋液）的高光谱信息和菌落总数。
1.3.2 光谱信息的采集
本实验采用反射模式进行高光谱信息采集，整个采集过程于黑色暗箱中完成以降低背景噪声的影响。在消除前后噪声波段区域后，有效波长范围设为400～1 000 nm，共420 个波段。经预实验设定最佳实验参数为：相机镜头和光源距拍摄物的距离分别为30.0 cm和20.5 cm，光源功率为90 W且光源以45°角对准样本，曝光时间为4 ms，输送速率为6.2 mm/s。高光谱采集系统详见图1。
图 1 高光谱系统结构示意图
Fig. 1 Schematic diagram of hyperspectral imaging system
光谱信息采集后对其进行黑白校正以消除噪声影响[24]。在样本图像采集相同的条件下，扫描聚四氟乙烯白板（反射率为99%）得到全白的反射图像，覆盖相机镜头得到全黑的反射图像，然后通过公式得到校正后的图像[25]。
式中：R为校正后信号强度；R0为原始信号强度；B为全黑的标定信号强度；W为全白的标定信号强度。
1.3.3 感兴趣区域的选择
利用高光谱图像技术分析样本的内部品质时，感兴趣区域的选择对之后的光谱预处理、建模分析和预测精度都有重要影响[26]。针对140 枚鸡蛋，分别将蛋清、蛋黄和全蛋液作为感兴趣区域，像素点数分别设为10 000、10 000 个和20 000 个，提取该区域内光谱平均值用于后续分析。
1.3.4 菌落计数
将采集完光谱信息的蛋清、蛋黄和全蛋液进行菌落计数后分别取平均值。参照GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》[13]进行测定。
采用Excel 2013和Origin 8.0软件进行数据统计分析和制图，利用ENVI 4.8系统软件和MATLAB 7.1统计工具箱建立样本光谱信息与菌落数量的关系模型。采用连续投影算法（successive projections algorithm，SPA）用于特征光谱筛选，通过偏最小二乘法回归（partial least squares，PLS）和SVM算法分别构建样品中菌落总数全波段回归模型和特征波段回归模型。以建模及预测集相关系数RC和RP、建模及预测均方根误差（root mean square error of calibration，RMSEC）和预测集均方根误差（root mean square error of prediction，RMSEP）用于模型性能评价。
图 2 蛋液中菌落总数变化
Fig. 2 Change in total viable count of bacteria in egg white, egg yolk and liquid whole egg
由图2a得出，随贮存时间的延长，两组样本蛋清中菌落数量变化趋势呈现S型曲线，存在明显的迟缓期和对数生长期，其中对照组变化相对平稳。污染组样本初始菌落数为3.2（lg（CFU/g）），在初始培养3 d内，菌落数量增幅仅为0.3（lg（CFU/g））；培养至第7天，增幅达到4.5（lg（CFU/g））。由于在接菌的初始阶段，蛋清中的抗菌成分（如溶菌酶和卵转铁蛋白等）仍对外界病源微生物起到抵抗作用[27-28]；此外，这也由菌种自身生长特性所决定，在接种至新的环境中，需要通过短暂调节才能实现后期的快速增长和繁殖，类似的研究现象也出现在琼脂平板和猪肉上[29]。统计对照组鸡蛋蛋清中菌落数量发现，在接种无菌生理盐水后，蛋清中菌落数量增长缓慢，整个贮存过程的上升幅度仅为3.4（lg（CFU/g））。远低于污染组中菌落总数。
不同于蛋清，蛋黄由蛋黄膜包裹，该膜具备选择透过性，对外来微生物有一定的抵抗作用，同时蛋黄中含有较多脂肪和脂蛋白，对微生物的生长具有一定的抑制作用[30]。在这种特殊防御体系下，当鸡蛋受到外源微生物感染时，蛋黄内部的微生物生长特性与在蛋清中的差异明显。由图2b可得，污染组的蛋黄贮存至第5天时出现微生物，并随着时间的延长呈现先上升后平稳的趋势。由于在第8天时微生物对蛋黄膜的破坏作用导致蛋黄膜破裂出现散黄的现象，因此将第7天作为实验的终点。而对照组的蛋黄始终未检出细菌，表明蛋黄受微生物污染程度远低于蛋清。
由图2c可得，全蛋液中菌落数量变化符合S型曲线，在生长过程中存在迟缓期（1～3 d）、对数生长期（3～8 d）以及平稳期（8～10 d），与蛋清中的生长曲线类似。污染后第5天菌落数量为5.26（lg（CFU/g）），超过国家相应标准[31]。至第8天时污染组鸡蛋液出现大面积的散黄，蛋清变绿并散发严重的腐败气味，其平均菌落数超过8.5（lg（CFU/g）），而对照组中菌落总数较缓慢地增长，至第10天时菌落总数仅为3（lg（CFU/g）），远低于污染组，此时依旧符合国家相应的微生物含量安全标准（4.70（lg（CFU/g）））。
2.2.1 光谱分析
图 3 不同污染程度的样本平均光谱反射率
Fig. 3 Average spectral reflectance of samples with different pollution levels
图3a为不同组分对应的平均光谱反射率及相对应的标准差，组分不同所对应的平均光谱反射率不同，光谱整体呈现先上升后下降的趋势。由图3b～d可知，样本中微生物含量越高，所对应的平均光谱反射率越低。造成这种现象可能的原因是：1）微生物在蛋清中进行生长繁殖，不断消耗蛋清中营养物质，致使蛋清结构发生变化，浓厚蛋白变稀[32]；2）微生物生长的中后期会产生大量的次级代谢产物（如色素、毒素等），进一步破坏蛋清原有结构，造成蛋液出现浑浊，致使样本光谱特性发生变化；3）微生物对蛋黄膜造成一定的破坏，进入蛋黄后在消耗蛋黄营养物质的同时，分泌次级代谢产物，使贮存后期的蛋黄表面出现一些颜色较深的病斑点，致使反射光的能力下降[33]。综上原因，对于鸡蛋液样本来说，随微生物数量的增加，蛋清和蛋黄均会发生相应的变化，导致整体鸡蛋液样本对可见-近红外光（400～1 000 nm）的吸收能力变强，反射率变小。
2.2.2 光谱预处理
原始全光谱波段中会存在大量与样本自身无关的冗余信息，因此本实验对光谱进行多种预处理。选取常用的5 种光谱预处理方法包括：变量标准化算法（standard normalized varite，SNV）、一阶导数、二阶导数、多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）和标准化（Autoscale），对蛋清、蛋黄和全蛋液样本的原始光谱进行预处理后分别建立PLS预测模型，分析结果如表1所示。
由表1可知，对于蛋清和全蛋液，原始光谱经预处理后，除Autoscale预处理外其他预处理方法下PLS模型的RCV均有所下降；交互验证均方根误差（root mean square error of cross validation，RMSECV）均有所上升，表明并不是所有的预处理方法都对模型的预测精度有所提高。因为大部分预处理方法在进行运算时可能会引入或放大噪声，或者减少光谱真正的样品信息，导致光谱信噪比下降和模型预测精度降低[34]；对于蛋黄，经SNV、一阶导数、二阶导数、MSC和几种预处理后所得模型的RCV均大于原始光谱的RCV，其中Autoscale预处理作用最明显，表明经光谱预处理后所建模型的效果均有所提升，这是因为相对于蛋清和全蛋液来说，蛋黄样本具有较大的信噪比，而只有在较大信噪比的情况下，光谱预处理后才能得到更好的效果，这也与吴静珠等[34]的研究一致。综上表明Autoscale法处理原始光谱，可以有效提升建模效果。
表 1 不同预处理方法下样本PLS校正模型的预测结果
Table 1 Performance of PLS calibration models with different pretreatment methods
类别 预处理方法最佳主成分数 RCV RMSECV（lg（CFU/g））蛋清原始光谱 2 0.81 0.54 SNV 3 0.76 0.58一阶导数 2 0.76 0.58二阶导数 3 0.78 0.61 MSC 3 0.77 0.59 Autoscale 2 0.83 0.51蛋黄原始光谱 3 0.57 0.71 SNV 3 0.64 0.69一阶导数 3 0.62 0.63二阶导数 5 0.67 0.62 MSC 3 0.64 0.69 Autoscale 2 0.78 0.51全蛋液原始光谱 2 0.75 0.70 SNV 2 0.72 0.74一阶导数 3 0.74 0.72二阶导数 5 0.70 0.78 MSC 1 0.73 0.74 Autoscale 2 0.79 0.65
2.2.3 建模及预测集样本的划分
农业行业标准[31]规定鸡蛋中菌落总数应低于50 000 CFU/g（4.70（lg（CFU/g））），故剔除菌落数量超标的38 个样本，根据K-S临近算法，对剩余102 个样本以2∶1的比例进行建模集和预测集的划分（建模集∶预测集=68∶34），样本统计结果见表2。样本建模集范围均涵盖预测集范围，表明样本的划分具有合理性。
表 2 校正集与预测集样本菌落数量的统计结果
Table 2 Statistical results of total viable count of bacteria in calibration and prediction sets
样本类 样本集 样品数量菌落总数（lg（CFU/g））最大值 最小值 ±s蛋清 建模集 68 4.48 0 2.73±0.93预测集 34 4.19 0.3 2.48±1.03蛋黄 建模集 68 2.76 0 0.69±0.82预测集 34 2.57 0 0.70±0.82全蛋液 建模集 68 4.63 0 2.50±1.07预测集 34 4.50 0 2.46±1.11
2.2.4 特征波长的提取
SPA是一种采用前向选择特征波段的算法，提取的特征波段具有共线性小、冗余度低的性能，可以代表样本整体的光谱信息[35]。因此，本实验采用SPA对样本全波段光谱进行特征波段的提取，结果如图4所示。
图 4 样本光谱的SPA筛选图和被选中的波段
Fig. 4 SPA screening of spectra and wavelengths selected
根据SPA得出的均方根误差（root mean square error，RMSE）作为挑选特征变量数的依据。如图4所示，蛋清、蛋黄和全蛋液样本的变量个数分别为11、12和15时，RMSE最小为0.48、0.54（lg（CFU/g））和0.69（lg（CFU/g）），此后随着变量数增加，RMSE不再减小，因此蛋清样本的特征波段数为11 个，蛋黄样本的特征波长数为12 个，鸡蛋样本的特征波段数为15 个，特征波长见表3。
表 3 特征波长
Table 3 List of characteristic wavelengths
样本 波段数 波长/nm蛋清 11 400、411、487、533、674、739、811、985、986、996、998蛋黄 12 521、549、569、581、600、672、743、767、843、921、979、1 000全蛋液 15 400、570、579、591、624、729、774、755、805、825、916、951、963、982、989
2.2.5 模型的建立
以全波段和SPA筛选出的特征波段下的光谱值为自变量，样本中菌落总数为因变量，分别建立PLS和SVM模型，模型结果见表4。
表 4 样本中菌落总数预测模型
Table 4 Predictive models for total viable count of bacteria in egg samples
样本 模型 光谱筛选 波段数校正集 预测集RC RMSEC（lg（CFU/g）） RP RMSEP（lg（CFU/蛋清PLS 全波段 420 0.84 0.50 0.79 0.67 SPA 11 0.84 0.50 0.78 0.69 SVM 全波段 420 0.85 0.50 0.80 0.64 SPA 11 0.85 0.50 0.81 0.63蛋黄PLS 全波段 420 0.79 0.50 0.78 0.51 SPA 12 0.86 0.41 0.80 0.50 SVM 全波段 420 0.85 0.43 0.82 0.47 SPA 12 0.86 0.42 0.82 0.47全蛋液PLS 全波段 420 0.80 0.65 0.75 0.77 SPA 15 0.78 0.67 0.72 0.79 SVM 全波段 420 0.80 0.65 0.75 0.76 SPA 15 0.83 0.60 0.75 0.75
由表4可得，对于蛋清样本，比较全波段-PLS和全波段-SVM模型，全波段-PLS模型中RC和RP（0.84和0.79）低于全波段-SVM模型中的RC和RP（0.85和0.80），RMSEP（0.67（lg（CFU/g）））高于SVM模型中的RMSEP（0.64（lg（CFU/g）））；经SPA算法筛选特征波段后所建的SPA-PLS模型中RP下降0.01，RMSEP上升0.02（lg（CFU/g）），SPA-SVM模型中RP上升0.01，RMSEP下降0.01（lg（CFU/g））。比较原始全波段光谱和特征波段光谱下的模型可发现二者预测精度相当，但SPA将波段数由420降为11 个，有效剔除了原始光谱中的冗余信息，大大提高了运算速度。因此SPA-SVM模型为最优的蛋清中菌落总数的预测模型。
对于蛋黄样本，全波段-PLS模型的RC为0.79，RP为0.78，RMSEC为0.50（lg（CFU/g）），RMSEP为0.51（lg（CFU/g）），其中R显著低于全波段-SVM模型中的RC和RP（0.85和0.82），RMSEC和RMSEP高于SVM模型中的RMSEC和RMSEP（0.43（lg（CFU/g））和0.47（lg（CFU/g）））；经SPA筛选特征波段后，SPA-PLS模型的RC提高至0.86，RP提高至0.80，RMSEC降为0.41（lg（CFU/g）），RMSEP降为0.50（lg（CFU/g）），而SPA-SVM模型中RC提高了0.01，RMSEC降低了0.01（lg（CFU/g）），RP和RMSEP未发生变化。表明对于PLS和SVM模型来说SPA可以有效提取特征波段，保留原始光谱的有效信息。因此SPASVM模型为最优的蛋黄中菌落总数的预测模型。
对于全蛋液样本，全波段-PLS和全波段-SVM模型的预测精度相当，其中RC均为0.80，RP均为0.75；SPA-PLS模型的RC（0.78）和RP（0.72）均有所下降，RMSEC（0.67（lg（CFU/g）））和RMSEP（0.79（lg（CFU/g）））均有所上升，而对于SPA-SVM模型，特征波段下模型的RC（0.83）有所上升，RMSEC（0.60（lg（CFU/g）））和RMSEP（0.75（lg（CFU/g）））均有所下降，这可能是由于模型的差异引起的。相对于SVM模型来说，PLS模型主要适用于多因变量对多自变量的回归建模，特别是当变量集合内部存在较高程度的相关性时，建模效果较优，而经SPA筛选特征波段后，大大降低了自变量之间的相关性，从而导致特征波段下的PLS模型预测精度低于全波段下的PLS模型，同时由于SVM模型更适用于小规模数据，所以对于全蛋液样本来说特征波段下的SVM模型预测精度高于全波段下的SVM模型。因此对于PLS模型来说，利用全波段光谱建模效果较好，对于SVM模型来说则是特征波段光谱建模效果好，但比较模型运算速度可以得出，SPA-SVM模型为最优的全蛋液中菌落总数的预测模型。
3 组样本中菌落总数预测模型效果如图5所示。
图 5 菌落总数SPA-SVM建模效果
Fig. 5 Validation of SPA-SVM models
在鸡蛋液污染过程中，微生物经历短暂适应期后快速繁殖扩增，并对蛋黄膜造成破坏，致使鸡蛋出现散黄腐败现象，侵染全过程均会严重影响光谱的吸收和反射特性。
对原始光谱进行预处理后建立PLS预测模型发现：Autoscale预处理效果相对最佳，对应蛋清样本的RCV和RMSECV为0.83和0.51（lg（CFU/g）），蛋黄样本的RCV和RMSECV为0.78和0.51（lg（CFU/g）），全蛋液样本的RCV和RMSECV为0.79和0.65（lg（CFU/g））。
对比全波段与特征波段下的蛋清、蛋黄和全蛋液样本的PLS和SVM预测模型发现，SPA-SVM预测效果最优。蛋清样本的RC和RP为0.85和0.81，RMSEC和RMSEP为0.50（lg（CFU/g））和0.63（lg（CFU/g））；蛋黄样本的RC和RP为0.86和0.82，RMSEC和RMSEP为0.42（lg（CFU/g））和0.47（lg（CFU/g））；全蛋液样本RC和RP为0.83和0.75，RMSEC和RMSEP为0.60（lg（CFU/g））和0.75（lg（CFU/g））；其中蛋清和蛋黄样本所建模型预测效果均高于全蛋样本所建模型。
在整个污染过程中，分析微生物在蛋液中生长情况和建模的效果表明，实际生产过程中建议选择蛋清的平均光谱对微生物进行预测。对于单个样本来说，整个预测过程只需几分钟便可完成，证实高光谱成像技术可以用于鸡蛋液中菌落污染程度的快速预测，为后续鸡蛋质量安全控制提供新的方案和思路。
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Rapid Prediction of Total Viable Count of Bacteria in Liquid Egg Using Hyperspectral Imaging Technology
屠康（1968—）（ORCID: 0000-0003-4314-2896），男，教授，博士，研究方向为农产品无损检测。E-mail: kangtu@njau.edu.cn
张伟（1987—）（ORCID: 0000-0003-0330-8628），男，讲师，博士，研究方向为农畜产品质量检测与控制。E-mail: zwperson@foxmail.com