线粒体是真核生物中生成生命所需能量的细胞器[1-5]，在正常的动物体内，肌红蛋白将氧气运送到线粒体中进行有氧呼吸作用[6-8]。动物宰后生命虽然结束，但胴体中的线粒体不会立刻停止活动，会继续进行一系列的氧化代谢反应[9-13]。曹锦轩等[14]研究了贮藏期间线粒体的损伤情况，得出线粒体结构与功能均随着贮藏时间的延长而遭到不同程度的损伤。透射电子显微镜可以对细胞及亚细胞的内部结构进行形态学观察[15-16]，原子力显微镜可以用来对细胞及亚细胞的外部结构进行形态学扫描[17-20]。
目前，国内外学者对影响肉色及其稳定性的内外部因素进行了大量研究[21-23]，但涉及到冷鲜牛肉贮藏过程中肌细胞线粒体超微结构变化与色泽变化相关性的研究较少。本实验研究了宰后牛肉4 ℃真空包装贮藏21 d，线粒体功能和结构变化对肉色的影响，从细胞学层面揭示了牛肉贮藏过程中肉色变化的微观机理，对开发牛肉贮藏过程中护色、保鲜技术和延长牛肉及其产品的货架期，具有理论指导意义。
新鲜牛肉购于宁夏盐池县大夏牧场肉食品有限公司。
线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测试剂盒、线粒体提取试剂盒、ATP检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、谷胱甘肽（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒 南京建成生物技术股份有限公司。其他试剂均为分析纯。
UV-1200紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；960MC型荧光分光光度计 上海精密仪器有限公司；Oxytherm氧电极 英国Hansatech公司；Optima L-100XP高速冷冻离心机 美国Beckman公司；HT 7700透射电子显微镜 日本日立公司；Nanoscope V原子力显微镜 美国Bruker公司；LB-QM6手持式ATP荧光检测仪 青岛路博伟业环保科技有限公司。
1.3.1 样品的预处理
牛胴体修整后，取双侧背最长肌，为尽可能减少其他因素对肉色变化的干扰，迅速去除残血、多余脂肪与结缔组织等，无菌生理盐水冲洗后，将肉样分成200 g左右肉块，4 ℃真空包装避光保藏21 d。以宰后当天作为第0天，每隔3 d取样进行指标测定。
1.3.2 肌红蛋白含量测定
肌红蛋白（m y o g l o b i n，M b）含量的测定参照Krzywicki[24]的方法，取待测5 g肉样，加入25 mL 0.04 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.8），在室温下用匀浆器均质（10 000 r/min、25 s，4 ℃）。静置60 min后，离心（4 500hg、4 ℃，20 min）。将上清液过滤，然后，采用紫外-可见分光光度计分别在525、545、565 nm和572 nm波长处测量其吸光度。Mb浓度及脱氧肌红蛋白（deomyoglobin，DeoMb）、氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，MbO2）与高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MetMb）相对含量分别按式（1）～（4）进行计算。
式中：R1、R2、R3分别为吸光度比值A572 nm/A525 nm、A565 nm/A525 nm、A545 nm/A525 nm。
1.3.3 牛骨骼肌线粒体的提取及指标测定
取10 g肉羊，用生理盐水洗净血水，线粒体的提取按照线粒体提取试剂盒说明书要求操作，以上过程均在4 ℃条件下完成。
1.3.3.1 线粒体耗氧量测定
首先将氧电极定标后，在反应杯中加入1.5 mL反应介质（含1 mmol/L蔗糖、10 mmol/L Tris、10 mmol/L乙二胺四乙酸、10 mmol/L磷酸二氢钾，pH 7.4）和0.5 mL 0.5 mg/mL线粒体悬浮液，待稳定后此时曲线即为I态呼吸曲线；加入0.2 mL琥珀酸钠（10 mmol/L），待稳定后所得曲线为II态呼吸曲线；加入0.5 mL ADP（0.05 mmol/L）后，此时的曲线即为III态呼吸曲线；待ADP消耗后，曲线斜率大幅下降，所得曲线即为IV态呼吸曲线。使用oxygraph软件测量曲线斜率，线粒体呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）按公式（5）[25]进行计算。
式中：ST3、ST4分别表示线粒体III态呼吸和ADP耗尽后线粒体IV态呼吸的耗氧量/（mmol/（mingmg））。
1.3.3.2 MMP测定
提取线粒体后用Mito Solution重悬线粒体沉淀，按照MMP检测试剂盒说明书要求操作。将0.9 mL试剂盒染色液加入到0.5 mg线粒体悬浮液中，避光37 ℃水浴20 min后，测定红色荧光（发射波长为590 nm、激发波长为525 nm）和绿色荧光（发射波长为530 nm、激发波长为490 nm）的强度，二者的比值即为MMP。
1.3.3.3 线粒体渗透转换孔开放状态检测
骨骼肌离体线粒体膜通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放状态检测参考彭艳艳等[26]的方法，并略作修改。将线粒体悬液加入到96 孔板中，再加入GENMED缓冲液（Reagent A，170 μL），混合均匀，在波长540 nm处采用酶标仪测量OD值，OD值越大，表明MPTP开放越大。
1.3.3.4 ATP含量测定
采用ATP测定试剂盒测定ATP含量。将ATP测定试剂平衡至室温后，取100 μL样品加入96 孔白板上，再加入新鲜提取的线粒体悬浮液50 μg，振荡30 s静置5 min立即用手持ATP荧光检测仪检测。
1.3.3.5 SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量检测
根据SOD检测试剂盒、GSH-Px检测试剂盒、CAT检测试剂盒和MDA检测试剂盒说明书操作，分别检测SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量。
1.3.3.6 对线粒体内部超微结构进行透射电子显微镜检测
将线粒体悬浮液离心（8 000hg，15 min），使肌细胞线粒体沉降，然后取截面为1 mm的沉淀，用体积分数2.5%戊二醛溶液固定过夜；磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2）漂洗4～5 次，每次15 min，之后用锇酸固定2 h；PBS（pH 7.2）漂洗5～6 次，每次15 min；用体积分数30%、50%、70%、80%乙醇溶液分别脱水15～30 min，然后依次90%乙醇脱水30 min、100%乙醇3 次30 min脱水和2 次纯丙酮30 min脱水；用胶水（601胶水，下同）置换丙酮，分别用V（胶水）∶V（丙酮）＝1∶3进行2 h、V（胶水）∶V（丙酮）＝1∶1进行4 h、V（胶水）∶V（丙酮）＝1∶3进行12 h、纯胶进行24 h；每个模具中先加入1 滴胶水，顺向放入一条线粒体块，再滴胶水使模具表面胶水略突出一点。放入30 ℃烘箱静置24 h，后调整温度至60 ℃，48 h烘干；取出样品块，用刀片修样、切片、染色，之后上机观察。
1.3.3.7 原子力显微镜检测线粒体外部形态结构
线粒体保存液中含有大量蔗糖，因此黏度较大，且容易有各类离子结晶干扰；所以实验前要将多余杂质清洗除去，防止干扰。首先将线粒体悬液滴加在处理后的洁净云母片上，直径不超过1 cm，放入4 ℃冰箱隔夜晾干，上镜检测，扫描范围20 μm。
1.3.3.8 线粒体损伤评分
观察透射电子显微镜（×5 000倍）下的线粒体数量并进行损伤评分，损伤评分的标准参照flameng分级，分为5 个等级，即0～4级，分别代表0～4 分；其中，0级表示线粒体的结构正常；1级表示线粒体结构内部凸起开始消失；2级表示线粒体肿胀，基质透明；3级表示线粒体内嵴分裂，基质呈透明状；4级表示线粒体基质丢失严重，线粒体内嵴分裂严重，内外膜开始缺失，呈现出空泡状。线粒体损伤评分按式（6）计算。
应用SPSS 18.0统计软件进行数据统计分析，平均数间比较用One-way ANOVA中的多重比较。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
图1 冷鲜牛肉贮藏过程中3 种形式肌红蛋白的相对含量
Fig.1 Relative contents of three myoglobins in beef muscle
健康畜禽屠宰后的胴体色泽由鲜红色变为暗红色主要是由于MbO2氧化成为了MetMb，MetMb不能及时还原为MbO2，造成MetMb的积累，从而使肉色逐渐向MetMb的深红色发展。由图1可见，在贮藏过程中，DeoMb相对含量与MbO2相对含量均逐渐下降，而MetMb相对含量则逐渐上升。
表1 冷鲜牛肉贮藏时间对肌细胞线粒体呼吸的影响
Table1 Effect of storage time on oxygen consumption of mitochondria in beef
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
贮藏时间/d ST4/（mmol/（mingmg））ST3/（mmol/（mingmg）） RCR 0 14.65f3.26a 11.88f4.06a 1.23f0.92a 3 10.68f2.93a 9.13f3.57a 1.16f0.73a 6 8.56f3.37a 6.08f2.29a 1.41f0.58a 9 3.23f1.92b 2.73f1.60b 1.18f1.04b 12 2.60f1.83b 1.91f1.16b 1.36f1.66b 15 2.11f1.37b 1.34f0.89b 1.57f2.02b 18 1.06f0.83b 0.81f0.62b 1.30f1.26b 21 0.57f0.33b 0.33f0.28b 1.72f1.69b
由表1可见，ST3和ST4随着贮藏时间的延长而降低，说明线粒体的呼吸功能在贮藏期间逐渐衰竭，能量代谢减缓。由于屠宰放血后机体死亡，而器官、组织的机能并没有同时停止运作，细胞仍在进行各种生命活动。线粒体离体后仍能进行一段时间的正常工作，当胴体血液循环停止或氧气供应中断时，线粒体呼吸功能由有氧呼吸逐渐转为无氧呼吸。其中贮藏时间9～21 d的耗氧量与0 d相比有显著性差异（P＜0.05）。
表 2 贮藏时间对肌细胞MPTP开放程度、MMP与ATP含量的影响
Table2 Effect of storage time on mitochondrial permeability transition pore and membrane potential and ATP content in beef
注：—.未检测出。表3同。
贮藏时间/d MPTP开放程度（OD540 nm）MMPATP含量/（μmol/g）0 0.89f0.71a 153.25f3.96a 9.95f2.06a 3 0.97f0.92a 127.70f2.09a 1.03f0.73b 6 1.05f0.89b 93.81f1.73b 0.63f0.08b 9 1.20f0.79b 83.60f2.07b 0.06f0.01c 12 1.48f1.03b 73.04f3.91b ü 15 1.60f0.71b 59.17f0.92b ü 18 1.73f0.66b 37.55f4.40b ü 21 1.92f0.39b 27.63f3.69b ü
MPTP属于多种蛋白组成的蛋白复合体，其位于线粒体内、外膜上[27]。由表2可知，随着贮藏时间的延长，MPTP开放程度呈增大的趋势，其中贮藏6～21 d的MPTP开放程度与0 d相比有显著性差异（P＜0.05）。随着贮藏时间延长，MMP呈降低的趋势，其中贮藏6～21 d的线粒体MMP与0 d相比有显著性差异（P＜0.05）。在贮藏过程中，MPTP开放使线粒体呼吸功能减退，从而导致线粒体MMP下降。贮藏3 d后，肌细胞中的ATP含量迅速降低，12 d后已检测不出，可能是随着贮藏时间的延长，肌肉中ATP酶变性失活导致。
表 3 贮藏时间对线粒体SOD、GSH-Px、CAT活力与MDA含量的影响
Table3 Effect of storage time on mitochondrial SOD, GSH-Px, CAT and MDA levels in beef
贮藏时间/d SOD活力/（U/mg）GSH-Px活力/（U/mg）CAT活力/（U/mg）MDA含量/（nmol/mg）0 13.64f0.96a 35.0f3.26a 5.60f1.92a 0.66f0.23a 3 10.33f0.81a 27.17f2.25a 4.17f0.78a 0.79f0.66a 6 7.41f1.20b 15.08f1.66b 2.66f0.89b 1.20f0.85b 9 5.30f1.76b 8.75f2.09b 1.83f1.12b 1.49f1.22b 12 0.32f0.95c 0.64f0.83c 0.34f0.07c 0.53f0.18a 15 0 0 0 0 18üüüü 21üüüü
由表3可见，随着贮藏时间的延长，SOD、GSH-Px、CAT活力降低，MDA含量先上升后下降。SOD、GSH-Px是机体两种主要的自由基清除酶，其活性可以反映机体清除氧自由基的能力[28]。贮藏0～9 d肌细胞线粒体内MDA含量明显升高，说明线粒体内氧自由基积累且无法及时分解。因此，贮藏0～9 d内线粒体SOD、GSH-Px、CAT活力降低，MDA含量上升，与线粒体的氧化应激反应有关。
随着牛肉贮藏时间的延长，线粒体肿胀，内部基质逐渐出现颗粒减少，内嵴分裂，内部出现囊泡，随后线粒体膜破裂崩塌，或形成空泡状结构，损伤达到一定程度后，线粒体膜发生破裂。
图2 各损伤等级的线粒体内部超微结构（×60 000）
Fig.2 Internal ultrastructure of mitochondria under different damage conditions (× 60 000)
选取6、15、21 d的超微结构图分别作为6～9、12～15、18～21 d的代表，因为这3 d的图中相应线粒体类型较多，具体如图2所示。贮藏0 d（图2A）的肌细胞线粒体呈比较规则的圆形或卵圆形，轮廓较为分明，结构完整，外膜完整光滑，基质分布均匀，内脊密集且清晰可见。贮藏3 d（图2B）与0 d的肌细胞线粒体相比无明显变化，外膜依然光滑完整，内部结构较良好，内脊轮廓清晰可见，少部分线粒体内部结构开始发生变化；贮藏6 d（图2C）肌细胞线粒体外膜基本完整，出现轻度的破损，内部结构基本良好，内脊开始分裂且数量减少；贮藏15 d（图2D）肌细胞线粒体外膜出现一定程度的破损，内脊开始大量分裂减少，膜结构开始有些模糊；贮藏18～21 d（图2E）的肌细胞线粒体绝大部分的线粒体外膜已经肿胀变性，破损溶解，内脊严重降解消失不见，基质透明，并出现空泡化，说明此时线粒体结构已严重受损。在不同贮藏时间下5 个级别的肌细胞线粒体都存在，只是所占比例不同。
由表4可得，贮藏时间与肌细胞线粒体的损伤程度成正比。贮藏时间越长，其平均评分值越大。由图2、表4可知，当贮藏时间达到21 d时，线粒体绝大部分发生自我损伤现象。在4 ℃贮藏过程中（0～21 d），0级线粒体数量逐渐减少，1～3级线粒体数量先增加后减少，4级线粒体数量逐渐增多，线粒体总评分先降低后升高，平均评分值从0.986 8升高到2.533 8，表明肌细胞线粒体结构完整性逐渐降低。
表4 fl ameng线粒体评分统计结果
Table4 Statistical results of mitochondria using fl ameng score standard
贮藏时间/d线粒体数量 平均得分0 级 1 级 2 级 3 级 4 级0 182 39 27 23 19 0.986 8 3 157 46 33 31 27 1.064 1 6 130 42 30 40 52 1.358 2 9 99 38 31 50 66 1.809 8 12 65 40 46 63 75 1.937 1 15 49 38 53 70 79 2.107 3 18 23 29 35 69 88 2.158 2 21 11 15 17 52 65 2.533 8
原子力显微镜可以对线粒体的外貌进行扫描，并找出对应线粒体内部超微结构变化5 个阶段（0～4 级）的外部形貌。
图3 各损伤等级的线粒体外表形貌
Fig.3 Exterior morphology of mitochondria at each level
如图3所示，贮藏前期（0 d）（图A），线粒体结构较为完整，外膜完整光滑，高度相对较高；随贮藏时间延长（图3B～E），线粒体高度降低，表面积增大，呈现塌陷状，线粒体嵴的囊泡化引起线粒体内膜不断伸展并压迫外膜，使其重新变得光滑。线粒体表面形貌的变化可能是线粒体内部结构逐步破坏导致的。线粒体从完整到破坏经过两个途径：一是线粒体部分膜结构先被分解，再加之内部增大的张力，从而使线粒体从一个小的突破点破裂，此时线粒体可能并没有肿胀，直径大小变化不明显，但是内部基质发生泄漏，从而使线粒体也发生了坍塌；另一种是，线粒体外膜结构完整，但是线粒体肿胀现象严重，内部结构中出现空泡结构，从而呈一个球状囊体结构，直径较完整时增大，损伤到最后，内部嵴结构消失，线粒体内部各种酶紊乱作用，促进内部结构自溶，内部嵴完全分裂，基质变透明，当线粒体内部达到一定的张力时，线粒体膜发生破裂，内外部结构发生崩塌[29-31]。
在贮藏期间牛肉肌细胞线粒体结构受到损伤，其功能也随之受到影响。线粒体结构损伤程度及功能变化与肌红蛋白氧化状态的相关性分析结果见表5。
表5 冷鲜牛肉贮藏过程中线粒体结构损伤程度及功能变化与肌红蛋白氧化状态的相关系数
Table5 Correlation coeff i cients between mitochondrial structural injury and functional changes and Mb oxidation state
注：*.显著相关（P＜0.05）；**.极显著相关（P＜0.01）。
指标 MbO2相对含量MetMb相对含量 RCR MPTP开放状态 MMP ATP含量MbO2相对含量 1.000 －0.962** 0.885** －0.792** 0.793* 0.619*MetMb相对含量 1.000 －0.809** 0.836** －0.902** －0.711*RCR 1.000 －0.791* 0.936** 0.970**MPTP开放状态 1.000 －0.865* －0.853**MMP 1.000 0.926**ATP含量 1.000
从表5中可以看出，线粒体结构损伤及功能变化与肉色稳定性有密切的关系，主要表现在背最长肌的RCR与MbO2相对含量极显著正相关（r＝0.885）（P＜0.01）。MMP与MetMb相对含量极显著负相关（r＝－0.902）（P＜0.01），表明随着MMP的升高，其MetMb相对含量逐渐降低。
线粒体RCR与MbO2相对含量呈极显著正相关，与MetMb相对含量呈极显著的负相关（P＜0.01），说明随着线粒体RCR升高，MbO2相对含量升高，MetMb相对含量降低，间接说明了线粒体结构损伤会使肉色的稳定性降低。MMP与MbO2相对含量呈极显著正相关（P＞0.05），与MetMb相对含量呈极显著负相关（P＜0.01），MPTP开放程度与MbO2相对含量呈极显著负相关（P＜0.01），与MetMb相对含量呈极显著正相关（P＜0.01），说明随着线粒体膜通透性的升高，MbO2相对含量降低，MetMb相对含量升高；随着MMP的降低，MbO2相对含量降低，MetMb相对含量升高，体内自由基无法得到及时的消除，并逐渐积累，其电离子非常活跃，容易与肌红蛋白分子中的极性残基和非极性残基结合，使其分子中的疏水区“隐藏”起来，使Fe2＋更容易被氧化，从而影响了Fe2＋与O2的可逆结合，最终导致MetMb还原为MbO2的速率降低，使肉色出现劣变。
此外，MMP与RCR、ATP含量均呈极显著正相关（P＜0.01），相关系数分别为0.936、0.926，说明RCR与ATP含量随着MMP的降低而降低，表明线粒体结构与功能之间的密切关系。
随着贮藏时间的延长，线粒体结构损伤严重，表现为膜通透性增大、线粒体形态和大小异常、正常的线粒体数量减少，进而导致其功能降低，SOD、GSH-Px、CAT活力降低，代谢产物MDA含量先升高后降低等。MMP与MbO2相对含量呈极显著正相关，与MetMb相对含量呈显著负相关；MPTP与MbO2相对含量呈极显著负相关，与MetMb相对含量呈极显著正相关，且线粒体功能的下降降低了肉色的稳定性。
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Correlation between Mitochondrial Change and Myoglobin Oxidation in Beef during Chilled Storage of Beef
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