膜分离与醇沉技术纯化猴头菇粗多糖的比较

蔡 铭,陈 思,骆少磊,杨 开,孙培龙*

(浙江工业大学海洋学院,浙江 杭州 310014)

摘 要:研究膜分离和醇沉两种技术对猴头菇粗多糖分离效果及其抗氧化活性的影响。以猴头菇子实体为原料,通过热水浸提后分别用醇沉、纳滤、纳滤+醇沉、微滤+纳滤、微滤+纳滤+醇沉5 种方法得到猴头菇粗多糖,分别记为A-He P、B-He P、C-He P、D-He P和E-He P。比较5 种方法对猴头菇粗多糖的分离纯化效果、理化性质和抗氧化活性的差异。结果表明,微滤+纳滤技术分离纯化效果较好,其粗多糖得率为10.08%,纯度为43.01%,提取液中80.34%的多糖得到保留。经傅里叶变换红外光谱分析,5 种工艺处理获得的粗多糖样品均具有典型的吡喃型葡聚糖和β-型糖苷键吸收峰。5 种处理获得的粗多糖样品中均含一定量的蛋白质,且B-He P的蛋白质量分数高于C-He P,说明微滤处理可以除去部分蛋白而提高多糖的纯度。还原力、·OH、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐阳离子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除结果表明,5 种粗多糖样品均具有一定的抗氧化能力,且D-He P的抗氧化能力最佳。

关键词:粗多糖;微滤;纳滤;醇沉

猴头菇(Hericium erinaceus),又称猴头菌、猴头、猴菇、猴蘑,属齿菌科,因其形状类似于猴头而得名,是我国珍贵的药食兼用真菌,有“蘑菇之王”的美誉[1]。猴头菇营养价值很高,具有多种生物活性,如抗溃疡、抗炎症、增强免疫力、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗突变、抑菌、保肝、提高机体耐缺氧能力、抗疲劳等作用[2-3]

多糖是机体内天然大分子之一,是由多个相同或不同的单糖通过糖苷键聚合成的高分子碳水化合物,广泛存在于高等植物、动物、真菌等体内[4]。多糖具有抗氧化、抗辐射、抗凝血、抗肿瘤、调节免疫力、抗疲劳、降血糖血脂等功能[2]。目前用于分离多糖的方法主要有醇沉法、离子交换树脂法、凝胶柱层析法、膜分离法等[5]。其中醇沉法是最传统的分离纯化方法,但该法获得的多糖得率较低、消耗有机试剂量大、分离所得多糖活性较低。膜分离法具有不损害分离物质生物活性、分离效率高、能耗低、设备简单、可连续生产、无污染等优点[6-7]

本实验主要采用醇沉、膜分离、膜分离+醇沉等技术对猴头菇子实体多糖进行分离。同时,对所得猴头菇粗多糖的分离纯化效果、结构和主要成分进行对比分析。讨论不同分离技术对猴头菇多糖体外抗氧化活性的影响。以期对猴头菇多糖的分离纯化技术进行改进,并为多糖物质的有效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猴头菇子实体粉末 北京福尔康生物技术研究所;浓硫酸、苯酚、考马斯亮蓝(G-250)、体积分数95%乙醇、葡萄糖(标准品)、过硫酸钾、VC、水杨酸、三氟乙酸(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt,ABTS) 上海阿拉丁试剂有限公司;福林-酚试剂 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅 江苏省金坛市医疗仪器厂;S-4700(II)场发射扫描电子显微镜、CR21GII高速冷冻离心机 日本日立公司;ALPHA2-4LD plus真空冷冻干燥机 德国Christ公司;AVATAR 370傅里叶变换红外光谱仪 美国Nicolet公司;UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司;SHB-III-A循环水真空泵 杭州大卫科教仪器公司;三联高压平板膜设备 厦门福美科技有限公司。

本实验使用错流膜分离实验装置,如图1所示。高压隔膜泵2提供实验所需要的操作压力,将料液泵入膜组件5(可拆卸更换膜)中进行膜分离,通过调节阀门8控制系统的操作压力,流量计3测定溶液流速,压力表4、7分别测定系统的进口压力和出口压力,计算跨膜压差,量筒6测定透过液的体积,最后被截留的液体返回储液罐1。

图1 膜分离装置示意图
Fig.1 Schematic diagram of the membrane separation device

1.3 方法

1.3.1 前处理

称取约50.00 g猴头菇粉于烧杯中,按料液比1∶20加入蒸馏水,80 ℃下浸提2 h,抽滤,滤渣重复上述浸提操作。合并两次滤液约2 000 mL作为后续实验的原料[8]

1.3.2 不同分离方法

1.3.2.1 醇沉分离工艺

取浸提液约2 000 mL,经旋转蒸发减压浓缩后按浸提液与乙醇体积比1∶3加入95%乙醇(乙醇终体积分数约为70%),放置过夜。离心,去上清液得沉淀,加水复溶后旋转蒸发去除有机溶剂,真空冷冻干燥得粗多糖,记为A-He P[9]

1.3.2.2 膜分离工艺

纳滤:取浸提液约2 000 mL,用截留分子质量300 Da的纳滤膜在1 MPa、600 r/min下进行纳滤浓缩,所得浓缩液经真空冷冻干燥得粗多糖,记为B-He P。

微滤+纳滤:取浸提液约2 000 mL,用0.1 μm的微滤膜在0.4 MPa、600 r/min下进行微滤预处理,微滤渗出液再经截留分子质量为300 Da的纳滤膜进行纳滤浓缩,最终所得浓缩液经真空冷冻干燥得粗多糖,记为D-He P。

1.3.2.3 膜分离+醇沉工艺

纳滤+醇沉:取浸提液约2 000 mL,用截留分子质量300 Da的纳滤膜在1 MPa、600 r/min下纳滤浓缩至300 mL,经旋转蒸发减压浓缩后按浸提液与乙醇体积比1∶3加入95%乙醇(乙醇终体积分数约为75%),放置过夜。离心,去上清液得沉淀,加水复溶后旋转蒸发去有机溶剂,真空冷冻干燥得粗多糖,记为C-He P。

微滤+纳滤+醇沉:取浸提液约2 000 mL,用0.1 μm的微滤膜在0.4 MPa、600 r/min下进行微滤预处理,微滤渗出液再经截留分子质量为300 Da的纳滤膜纳滤浓缩至300 mL,经旋转蒸发减压浓缩后按浸提液与乙醇体积比1∶3加入95%乙醇(乙醇终体积分数约为75%),放置过夜。离心,去上清液得沉淀,加水复溶后旋转蒸发去有机溶剂,真空冷冻干燥得粗多糖,记为E-He P。

工艺流程如图2所示。

图2 膜分离+醇沉工艺流程图
Fig.2 Flow chart of membrane separation + ethanol precipitation

1.3.3 粗多糖理化性质分析

1.3.3.1 总糖质量的测定

总糖质量的测定采用苯酚-硫酸测定法[10]。取0.5 g冷冻干燥多糖样品定溶于100 mL容量瓶,取1 mL定容于50 mL容量瓶。精确吸取样品溶液2.0 mL,加入质量分数6%苯酚1 mL、浓硫酸5 mL,振荡摇匀后沸水浴15 min,取出后迅速冷却至室温,测定490 nm波长处的吸光度,以蒸馏水为空白对照。采用葡萄糖标准品建立标准曲线,计算总糖质量。

1.3.3.2 还原糖质量的测定

还原糖质量的测定采用二硝基水杨酸法[11]。取1.0 mL样品于25 mL具塞试管中,加入3 mL二硝基水杨酸试剂,采用振荡器混匀。沸水浴5 min后迅速冷却至室温,定容至25 mL,摇匀。于540 nm波长处测定吸光度,以蒸馏水为空白对照。采用葡萄糖标准品建立标准曲线,计算还原糖质量。总糖质量与还原糖质量之差为多糖质量。

1.3.3.3 提取物中蛋白质量的测定

提取物中蛋白质量的测定采用考马斯亮蓝法[12]。以牛血清白蛋白作标准曲线,取10 mg牛血清白蛋白于容量瓶中,用蒸馏水溶解后定容至100 mL,向6 支试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL牛血清白蛋白标准品溶液,各管用蒸馏水补足1 mL。再加入考马斯亮蓝G-250试剂5.0 mL,在漩涡振荡器上混匀。10 min后测定在595 nm波长处的吸光度,以蒸馏水作空白,绘制标准曲线,根据标准曲线计算样品中蛋白的质量。

1.3.3.4 多酚质量的测定

多酚质量的测定参考Kumazawa[13]和Mello[14]等的方法并稍加修改。将冷冻干燥后的多糖用蒸馏水配制成1 mg/mL多糖溶液。取1 mL于试管中,加入5 mL质量分数10%福林-酚试剂,摇匀反应3~8 min,然后加入4.0 mL质量分数7.5% Na2CO3溶液,摇匀。室温下放置60 min后在765 nm波长处测吸光度。以蒸馏水为空白对照,用没食子酸标准品建立标准曲线,计算样品中多酚的质量。

1.3.3.5 糖醛酸质量的测定

糖醛酸质量的测定采用间羟联苯法[15]。将冷冻干燥后的多糖用蒸馏水配制成1 mg/mL多糖溶液,取1.0 mL于冰水浴中预冷放置一段时间后,加入配制好的四硼酸钠-硫酸溶液5 mL。振荡混匀,于沸水中加热10 min,冷却至室温后加入100 μL 1.5 mg/mL间羟联苯试剂。振荡5 min让其充分混匀,静置1 h后测定其在525 nm波长处的吸光度。以蒸馏水作空白,用葡萄糖醛酸标准品建立标准曲线,计算样品中糖醛酸的质量。

1.3.3.6 提取液成分分析

按式(1)计算提取液中多糖、还原糖、蛋白质、多酚、糖醛酸提取率。

1.3.3.7 粗多糖成分分析

按式(2)计算多糖得率,按式(3)计算多糖、蛋白质、多酚、糖醛酸质量分数,按式(4)计算多糖保留率,按式(5)计算多糖、还原糖、蛋白质、多酚、糖醛酸质量浓度。

1.3.4 粗多糖结构及形态分析

1.3.4.1 傅里叶变换红外光谱分析

参考Nejatzadeh-Barandozi等[16]方法。取2 mg干燥猴头菇粗多糖样品,加入200 mg干燥溴化钾粉末在玛瑙研钵中混合均匀并研细,用压片机将其压成薄片,用傅里叶变换红外光谱仪在4 000~500 cm-1范围内扫描。

1.3.4.2 紫外光谱分析

参考Cui Jie等[17]的方法。取10 mg干燥猴头菇粗多糖样品,用蒸馏水溶解配制成1.0 mg/mL多糖溶液,用UV-2450型紫外-可见分光光度计在190~400 nm波长范围内对其进行扫描,得到紫外吸收光谱。

1.3.4.3 扫描电子显微镜分析

取少量5 种猴头菇多糖,用棉签将其粘贴在双面导电胶的载物台上,用洗耳球吹去没有粘住的多糖粉末。将其放置在离子溅射仪中进行喷箔处理,再将处理好的样品按顺序放入扫描电子显微镜下,待仪器设置稳定之后观察其形貌[18]

1.3.5 抗氧化活性分析

分别将5 种粗多糖配成0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mg/mL 7 个不同质量浓度的多糖水溶液备用。

1.3.5.1 还原力测定

取不同质量浓度的多糖溶液1 mL,加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲液1 mL和质量分数1%铁氰化钾溶液1.0 mL混匀。50 ℃保温反应20 min后加入质量分数10%三氯乙酸溶液1.0 mL,冷却至室温,再加入1.0 mL质量分数0.1% FeCl3溶液。反应10 min后测定700 nm波长处的吸光度Ax。以VC作为阳性对照。用等体积的蒸馏水作空白对照,测得吸光度A0[19]。以吸光度表示还原力,按式(6)计算。

1.3.5.2 gOH清除率测定

量取0.8 mL各质量浓度的猴头菇多糖溶液,分别加入浓度为2 mmol/L的FeSO4溶液2 mL、2 mmol/L的水杨酸1 mL和体积分数为0.1%的H2O2溶液1 mL。在37 ℃恒温水浴1 h,冷却至室温,测定其在510 nm波长处的吸光度Ai。以蒸馏水作空白,同等条件下测吸光度A0;对照组采用蒸馏水代替水杨酸溶液,同等条件下测得吸光度Aj[20]。·OH清除率按式(7)计算。

1.3.5.3 ABTS阳离子自由基清除率测定

ABTS储备液的制备:量取8 mL浓度为7 mmol/L的ABTS溶液和141 μL浓度为140 mmol/L的过硫酸钾溶液,将两者混合后于4 ℃下避光反应12~16 h。用pH 7.4、10 mmol/L磷酸盐缓冲液稀释储备液至吸光度为1.00f0.02后备用。分别量取1 mL各质量浓度的猴头菇多糖溶液,加入ABTS溶液3 mL,混匀后避光反应1 h,测定在734 nm波长处的吸光度Ai。用1 mL蒸馏水作空白对照,同等条件下测得吸光度A0;样品对照组用3 mL蒸馏水替代ABTS溶液,测得吸光度Aj[21]。ABTS阳离子自由基清除率按式(8)计算。

1.3.5.4 DPPH自由基清除率测定

分别量取2 mL不同质量浓度的多糖溶液于具塞试管中,加入0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液1 mL,密封后混匀,于25 ℃恒温避光反应1 h,测定517 nm波长处的吸光度Ai。用等体积的甲醇溶液代替DPPH溶液为对照组,同等条件下测得吸光度Aj。为消除多糖溶液对吸光度的影响,用等体积的蒸馏水代替多糖样品溶液作空白对照,测吸光度A0[22]。DPPH自由基清除率按式(9)计算。

1.4 数据处理与分析

本实验所有数据均重复测定3 次,使用SPSS 18.0软件进行数据处理,采用Origin 8.5.1软件作图。

2 结果与分析

2.1 粗多糖理化性质分析

2.1.1 提取液成分分析

图3 猴头菇提取液主要成分
Fig.3 Major components of Hericium erinaceus extract

从图3中可以看出,猴头菇提取液中多糖的质量浓度及提取率明显高于其他4 种成分。

2.1.2 粗多糖成分分析

图4 猴头菇粗多糖主要成分分析
Fig.4 Principal components of crude polysaccharides from Hericium erinaceus

由图4A可知,纳滤所得粗多糖的得率约为醇沉的3 倍,表明醇沉会损失大量的多糖。粗多糖样品中多糖的质量分数即粗多糖样品的纯度,由图4B可知,E-He P的纯度最高,B-He P最低;5 种粗多糖中的蛋白质量分数也有差异,B-He P大于D-He P,即经过微滤处理所得的粗多糖中蛋白质量分数比纳滤浓缩要低,说明微滤可以除去部分蛋白质;醇沉和膜分离+醇沉所得粗多糖中糖醛酸质量分数较高,约为膜分离的3 倍,A-He P、C-He P、E-He P中糖醛酸质量分数分别为15.08%、16.58%、16.48%,说明醇沉处理得到的粗多糖中含有较多的酸性多糖。如图4C所示,膜分离可以保留提取液中约80%的多糖,而醇沉和膜分离+醇沉分离所得的多糖保留率仅为30%左右,即醇沉处理会让大部分多糖损失。由图4B、C可以得出,微滤+纳滤+醇沉所得粗多糖的纯度虽然最高,却损失了大部分的多糖,微滤+纳滤可以保留提取液中的较多的多糖,且所得多糖纯度较高。

2.2 粗多糖结构及形态分析

2.2.1 傅里叶变换红外光谱分析

图5 猴头菇粗多糖傅里叶变换红外光谱图
Fig.5 FTIR spectra of crude polysaccharides from Hericium erinaceu

由图5可知,5 种多糖样品结构基本一致,均具有典型的多糖特征吸收峰[23]。在3 370 cm-1附近有较强吸收峰,为糖类OüH的伸缩振动吸收峰;在2 932 cm-1附近出现由CüH伸缩振动引起的吸收峰,包括üCH、üCH2、üCH3的伸缩和弯曲振动;1 049 cm-1处出现的较强吸收峰是糖环中CüOüC伸缩振动吸收峰,这3 个峰是糖类化合物的典型特征吸收峰。吸收峰越强,说明多糖含量越高。苏平等[24]对黄秋葵花多糖红外光谱图分析显示,不同提取方法所得的4 种黄秋葵花多糖在3 385 cm-1附近都出现了强而宽的吸收峰,是OüH伸缩振动的结果,表明多糖的分子内和分子间均存在氢键。Li Xiaoyu等[25]用红外光谱研究了黄芪多糖的结构,图谱表示在1 040 cm-1附近的吸收带是属于CüOüC的拉伸振动。这些都与猴头菇粗多糖的特征吸收峰在傅里叶变换红外光图谱中有相似的表现。

猴头菇粗多糖在1 646 cm-1附近出现酰胺I带吸收峰,是蛋白质的特征光谱。樊伟伟等[26]用红外光谱研究了超声波辅助提取所得猴头菇多糖的结构,其在1 644 cm-1处出现乙酰氨基的吸收峰,表明此处吸收峰为蛋白质。猴头菇多糖在1 406、1 233 cm-1处有较小的吸收峰,说明含有少量酚类[27]

在889 cm-1处的吸收峰表明猴头菇粗多糖中存在β-构型糖。539 cm-1处吸收峰为吡喃型糖环特征。Kuang Haixue等[28]曾对麻黄茎多糖进行红外光谱分析,发现其在833 cm-1处具有β-构型吸收峰,这与猴头菇粗多糖官能团在图谱中的表现相似。

2.2.2 紫外光谱分析

图6 猴头菇粗多糖紫外光谱图
Fig.6 Ultraviolet spectra of crude polysaccharides from Hericium erinaceus

从图6中可以看出,5 种粗多糖紫外光谱图相似。在260~280 nm波长处有吸收峰,说明粗多糖样品中含有核酸和蛋白质。B-He P蛋白质含量(260~280 nm波长处吸收峰)高于D-He P,表明通过微滤处理可以除去部分蛋白质。通过醇沉处理所得3 种粗多糖中蛋白质量分数比只经过膜分离的低。与粗多糖样品中蛋白质量分数排序(B-He P>D-He P>C-He P>A-He P>E-He P)结果一致。2.2.3 粗多糖的微观形态观察结果

图7 不同方法分离后粗多糖的表面结构
Fig.7 Surface structures of crude polysaccharides separated by different methods

如图7所示,A-He P主要为较大的块状,B-He P、D-He P主要为棒状,C-He P、E-He P主要为片状。结果表明膜分离与醇沉技术分离得到的猴头菇多糖有较大的形貌差异:膜分离所得多为棒状;醇沉处理所得为较大块状;膜分离+醇沉所得为片状。

2.3 猴头菇粗多糖的体外抗氧化活性分析

2.3.1 还原力比较

多糖提供电子将Fe3+还原成Fe2+,Fe2+在700 nm波长处有强吸收,吸光度越大则表明还原力越强。如图8所示,5 种粗多糖组分还原力均随样品质量浓度上升而升高,且存在一定的剂量-效应关系。D-He P还原力最强,最高可达2.21,略高于B-He P,明显高于醇沉及膜分离+醇沉所得的3 种多糖;E-He P还原力最弱。

图8 猴头菇粗多糖的还原力
Fig.8 Reducing power of crude polysaccharides from Hericium erinaceus

崔芳源[29]通过Sevag法脱蛋白所得猴头菇醇沉多糖的还原力为0.4,低于D-He P,说明通过微滤除蛋白所得多糖的还原力较Sevag法所得的高。黄越等[7]用水提醇沉法得到猴头菇粗多糖,在质量浓度为5 mg/mL时,700 nm波长处的吸光度为1.21,略低于A-He P。Liu Yong等[30]研究了金钱菇多糖的还原能力,当质量浓度为5 mg/mL时,其还原力仅为0.27。Kozarski等[31]对灵芝多糖的还原能力进行研究,当质量浓度为5 mg/mL时,其还原力仅为0.23。说明猴头菇粗多糖具有良好的还原力,尤其是微滤+纳滤处理组。

2.3.2 gOH清除率比较

图9 猴头菇粗多糖对gOH的清除率
Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of crude polysaccharides from Hericium erinaceus

gOH具有极强的氧化能力,是自然界中氧化能力仅次于氟的氧化剂。多糖对Fenton体系产生的·OH有一定的清除作用。如图9所示,5 种粗多糖组分的·OH清除能力与样品质量浓度均呈正相关关系。E-He P清除能力最强,B-He P清除能力最弱。但是各多糖的·OH清除能力相差不大。当质量浓度达到5 mg/mL时,5 种粗多糖的清除率都可达到80%以上,对·OH都有较好的清除能力。

陆武祥等[32]研究显示猴头菇多糖对·OH的清除率可达86.9%,与本研究结果相近。Liu Yong等[30]研究了金钱菇多糖对·OH的清除效果,质量浓度为5 mg/mL时其对·OH的清除率仅为24.30%。Zhang Zuofa等[33]对金针菇多糖·OH清除率的研究结果显示,当质量浓度为5 mg/mL时,其·OH清除率为36.87%。表明猴头菇粗多糖相较其他多糖有更好的·OH清除能力,其中E-He P效果较佳。

2.3.3 ABTS阳离子自由基清除率比较

ABTS阳离子自由基是一种稳定的有机自由基,可以通过ABTS溶液与过硫酸钾在室温黑暗中反应12~16 h产生。在抗氧化剂存在的情况下ABTS阳离子自由基将会减少。通过测定反应液在734 nm波长处的吸光度变化,可得知多糖对ABTS阳离子自由基的清除效果。

图10 猴头菇粗多糖对ABTS阳离子自由基的清除效果
Fig.10 ABTS radical scavenging capacity of crude polysaccharides from Hericium erinaceus

如图10所示,5 种粗多糖对ABTS阳离子自由基都有很好的清除能力,且均随着样品质量浓度的升高而增强。通过膜分离所得粗多糖ABTS阳离子自由基清除率随样品质量浓度增加而上升,且升高速度比醇沉和膜分离+醇沉得到的粗多糖快,其中D-He P升速最快,A-He P升速最慢,在2.0 mg/mL时5 种粗多糖清除率都达到最大值100%。A-He P与黄越等[7]用水提醇沉法得到的猴头菇粗多糖一样都具有很好的清除效果,在质量浓度为0.5 mg/mL时对ABTS阳离子自由基的清除率达到80%。Li Chao等[34]对3 种夏枯草多糖的ABTS阳离子自由基清除率进行研究,质量浓度为0.5 mg/mL时3 种夏枯草多糖对ABTS阳离子自由基的清除率分别为6.2%、16.6%和12.8%。Liu Yong等[30]对金钱菇多糖的ABTS阳离子自由基清除效果进行研究,质量浓度为5 mg/mL时其对ABTS阳离子自由基的清除率为63.96%,明显低于猴头菇粗多糖。表明猴头菇粗多糖具有良好的ABTS阳离子自由基清除能力,可作为良好的ABTS阳离子自由基清除剂,特别是微滤+纳滤处理组。

2.3.4 DPPH自由基清除能力比较

DPPH自由基是一种有机氮自由基,在517 nm波长处有最大吸收峰,当DPPH自由基与抗氧化剂反应后会被还原,使其在517 nm波长处的吸光度降低,可以通过此方法测定多糖对DPPH自由基的清除能力。

如图11所示,5 种粗多糖对DPPH自由基的清除率都随着样品质量浓度的升高而升高,且存在一定的剂量-效应关系。其中,D-He P清除能力最强,当质量浓度达到1.5 mg/mL时清除率超过50%,最高可达到64.7%;A-He P清除能力最弱,清除率最高为53.6%;各组多糖的清除能力相差不明显。

图11 猴头菇粗多糖对DPPH自由基的清除效果
Fig.11 DPPH radical scavenging capacity of crude polysaccharides from Hericium erinaceus

黄越等[7]用水提醇沉法得到猴头菇粗多糖,在质量浓度为5 mg/mL时,其清除率约为47.91%,略低于A-He P。D-He P与崔芳源[29]通过Sevag法脱蛋白所得猴头菇醇沉多糖的DPPH自由基清除率相差不大,说明通过微滤和Sevag法脱蛋白所得多糖对DPPH自由基清除效果相似。本研究所得猴头菇粗多糖具有较好的DPPH自由基清除能力,尤其是微滤+纳滤处理组。

3 结 论

本研究采用醇沉、纳滤、纳滤+醇沉、微滤+纳滤、微滤+纳滤+醇沉5 种方法分离猴头菇粗多糖。主要结论如下:1)5 种粗多糖样品的得率排序为:B-He P>D-He P>A-He P>C-He P>E-He P;多糖纯度排序为:E-He P>C-He P>A-He P>D-He P>B-He P。膜分离+醇沉所得多糖纯度高但得率低,有大量多糖损失;纳滤所得多糖的得率最高,但纯度最低;微滤+纳滤所得多糖的得率和纯度都较高(得率为10.08%,纯度为43.01%),提取液中80.34%的多糖得到保留。5 种多糖样品中均含蛋白质,且B-He P中的蛋白质量分数高于D-He P。因此,微滤处理可以除去部分蛋白而提高多糖的纯度。醇沉和膜分离+醇沉所得3 种粗多糖中糖醛酸的质量分数约为膜分离的3 倍,表明醇沉处理所得的粗多糖中含有较多的酸性多糖。2)在粗多糖的结构与形态分析中,傅里叶变换红外光谱显示5 种粗多糖样品在化学结构上类似,都含有多糖的特征吸收峰;扫描电子显微镜观察表明膜分离与醇沉技术分离所得多糖有较大的形貌差异,膜分离所得多为棒状,醇沉所得为较大块状,膜分离+醇沉所得为片状。3)对5 种粗多糖样品的还原力和gOH、ABTS阳离子自由基、DPPH自由基清除率的分析结果表明,5 种粗多糖均具有一定的抗氧化能力,其中D-He P的抗氧化能力最佳。

参考文献:

[1] 郑盈盈, 刘国强. 猴头菇药理活性的基础研究现状[J]. 临床合理用药杂志, 2016, 9(5): 171-172. DOI:10.15887/j.cnki.13-1389/r.2016.05.123.

[2] WANG M X, GAO Y, XU D D, et al. Hericium erinaceus(Yamabushitake): a unique resource for developing functional foods and medicines[J]. Food & Function, 2014, 5(12): 3055-3064.DOI:10.1039/c4fo00511b.

[3] CHAIYAVAT C, BHAGAVATHI S S. Anti-hyperglycemic property of Hericium erinaceus: a mini review[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2017, 7(11): 1036-1040. DOI:10.1016/j.apjtb.2017.09.024.

[4] 薛丹, 黄豆豆, 黄光辉, 等. 植物多糖提取分离纯化的研究进展[J]. 中药材, 2014, 37(1): 157-161. DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.01.050.

[5] 张淑杰, 康玉凡. 天然活性多糖研究进展[J]. 食品工业科技, 2017,38(2): 379-382; 389. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.065.

[6] 裴小平. 猴头菇多糖的提取方法及其开发应用研究进展[J].安徽农业科学, 2016, 44(34): 38-42. DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2016.34.015.

[7] 黄越, 周春晖, 黄惠华. 不同提取方法猴头菇粗多糖的表征及其抗氧化活性的比较[J]. 食品工业科技, 2017, 38(3): 80-86.DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.007.

[8] 吴志明, 李公斌, 辛秀兰, 等. 猴头菇多糖的提取工艺[J].食品研究与开发, 2011, 32(7): 36-38. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2011.07.011.

[9] 魏华, 张娣, 陆玲, 等. 几种食用菌多糖的提取与抗氧化性研究[J].南京师大学报(自然科学版), 2017, 40(2): 72-75; 88. DOI:10.3969/j.issn.1001-4616.2017.02.012.

[10] LIU D, WONG P T S, DUTKA B J. Determination of carbohydrate in lake sediment by a modif i ed phenol-sulfuric acid method[J]. Water Research, 1973, 7(5): 741-746. DOI:10.1016/0043-1354(73)90090-0.

[11] 王俊刚, 张树珍, 杨本鹏, 等. 3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定甘蔗茎节总糖和还原糖含量[J]. 甘蔗糖业, 2008(5): 45-49. DOI:10.3969/j.issn.1005-9695.2008.05.010.

[12] BITTER T, MUIR H M. A modif i ed uronic acid carbazole reaction[J].Analytical Biochemistry, 1962, 4(4): 330-334. DOI:10.1016/0003-2697(62)90095-7.

[13] KUMAZAWA S, HAMASAKA T, NAKAYAMA T. Antioxidant activity of propolis of various geographic origins[J]. Food Chemistry,2004, 84(3): 329-339. DOI:10.1016/0003-2697(62)90095-7.

[14] MELLO B C B S, PETRUS J C C, HUBINGER M D. Concentration of fl avonoids and phenolic compounds in aqueous and ethanolic propolis extracts through nanof i ltration[J]. Journal of Food Engineering, 2010,96(4): 533-539. DOI:10.1016/j.jfoodeng.2009.08.040.

[15] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1): 248-254.DOI:10.1006/abio.1976.9999.

[16] NEJATZADEH-BARANDOZI F, ENFERADI S T. FT-IR study of the polysaccharides isolated from the skin juice, gel juice, and fl ower of Aloe vera tissues affected by fertilizer treatment[J]. Organic &Medicinal Chemistry Letters, 2012, 2(1): 1-9. DOI:10.1186/2191-2858-2-33.

[17] CUI Jie, GU Xin, WANG Fengjun, et al. Purif i cation and structural characterization of an α-glucosidase inhibitory polysaccharide from apricot (Armeniaca sibirica L. Lam.) pulp[J]. Carbohydrate Polymers,2015, 121(6): 309-314. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.12.065.

[18] 宋思圆. 黄秋葵花多糖的超声提取及其结构和抗氧化活性研究[D].杭州: 浙江大学, 2017: 19-20.

[19] TIAN L M, ZHAO Y, GUO C, et al. A Comparative study on the antioxidant activities of an acidic polysaccharide and various solvent extracts derived from herbal Houttuynia cordata[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 83(2): 537-544. DOI:10.1016/j.carbpol.2010.08.023.

[20] MAO G H, ZOU Y, FENG W W, et al. Extraction, preliminary characterization and antioxidant activity of Se-enriched Maitake polysaccharide[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 101: 213-219.DOI:10.1016/j.carbpol.2013.09.034.

[21] RE R, PELLEGRINI N, PROTEGGENTE A, et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1999, 26(9/10): 1231-1237. DOI:10.1016/j.carbpol.2010.08.023.

[22] YANG B, ZHAO M M, SHI J, et al. Effect of ultrasonic treatment on the recovery and DPPH radical scavenging activity of polysaccharides from longan fruit pericarp[J]. Food Chemistry, 2008, 106(2): 685-690.DOI:10.1016/j.foodchem.2007.06.031.

[23] 宁永成. 有机化合物结构鉴定与有机波谱学[M]. 北京: 科学出版社,2014: 260-265.

[24] 苏平, 孙昕, 宋思圆, 等. 不同提取方法对黄秋葵花多糖的结构组成及抗氧化活性的影响[J]. 食品科学, 2018, 39(15): 93-100.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201815014.

[25] LI Xiaoyu, WANG Lu. Effect of extraction method on structure and antioxidant activity of Hohenbuehelia serotina polysaccharides[J].International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 83: 270-276. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2015.11.060.

[26] 樊伟伟, 何进武, 侯萍, 等. 超声波辅助提取猴头菇多糖的研究[J]. 包装与食品机械, 2017, 35(2): 6-10. DOI:10.3969/j.issn.1005-1295.2017.02.002.

[27] 赵玉红, 翟亚楠, 王振宇. 樟子松树皮多酚的成分分析和结构鉴定[J].北京林业大学学报, 2016, 38(1): 125-130. DOI:10.13332/j.1000-1522.20140285.

[28] KUANG Haixue, XIA Yonggang, LIANG Jun, et al. Structural characteristics of a hyperbranched acidic polysaccharide from the stems of Ephedra sinica and its effect on T-cell subsets and their cytokines in DTH mice[J]. Carbohydrate Polymers, 2011, 86(4):1705-1711. DOI:10.1016/j.carbpol.2011.07.001.

[29] 崔芳源. 猴头菇胞内胞外多糖的结构、抗氧化活性和保肝护肝能力分析[D]. 泰安: 山东农业大学, 2016: 33-34.

[30] LIU Yong, DU Yiqun, WANG Junhui, et al. Structural analysis and antioxidant activities of polysaccharide isolated from Jinqian mushroom[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2014, 64(2): 63-68. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2013.11.029.

[31] KOZARSKI M, KLAUS A, NIKSIC M, et al. Antioxidative andimmunomodulating activities of polysaccharide extracts of themedicinal mushrooms Agaricus bisporus, Agaricus brasiliensis,Ganoderma lucidum and Phellinus linteus[J]. Food Chemistry, 2011,129(4): 1667-1675. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.06.029.

[32] 陆武祥, 王东华, 王秀英, 等. 5 种食用菌液体发酵菌丝抗氧化活性分析比较[J]. 食品与发酵工业, 2013, 39(7): 124-127. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2013.07.006.

[33] ZHANG Zuofa, LÜ Guoying, HE Weiqing, et al. Effects of extraction methods on the antioxidant activities of polysaccharides obtained from Flammulina velutipes[J]. Carbohydrate Polymers, 2013, 98(2):1524-1531. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.07.052.

[34] LI Chao, HUANG Qing, FU Xiong, et al. Characterization, antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides from Prunella vulgaris Linn.[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2015, 75: 298-305. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2015.01.010.

Comparison of Membrane Separation and Alcohol Precipitation for the Separation of Crude Polysaccharides from Hericium erinaceus

CAI Ming, CHEN Si, LUO Shaolei, YANG Kai, SUN Peilong*
(Ocean College, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract: We compared the effects of membrane separation and alcohol precipitation on the separation efficiency and antioxidant activity of crude polysaccharides from Hericium erinaceus. Five different methods including alcohol precipitation, nanofiltration, nanofiltration + alcohol precipitation, microfiltration + nanofiltration and microfiltration +nanof i ltration + alcohol precipitation were used in this study to obtain crude polysaccharides from the hot water extract from Hericium erinaceus, designated A-He P, B-He P, C-He P, D-He P and E-He P, respectively. The separation eff i ciencies of the fi ve methods and the physicochemical properties and antioxidant activity of the crude polysaccharides were compared.Results showed that microf i ltration + nanof i ltration was the best method for the separation of crude polysaccharides. This method gave a polysaccharide yield of 10.08% and a purity was 43.01%, and recovered 80.34% of the polysaccharides in the extract. All fi ve crude polysaccharides exhibited the typical absorption peaks of pyran-type glucan and β-glycosidic bond in the Fourier transform infrared (FTIR) spectra. In addition, these polysaccharides contained protein, and the protein content in B-He P was higher than that in C-He P, indicating that some proteins could be removed by microf i ltration. Moreover, the crude polysaccharides had antioxidant capacity as evaluated by reducing power, ·OH, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),hydroxyl and 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) radical scavenging assays; D-He P had the best antioxidant capacity.

Keywords: crude polysaccharides; microf i ltration; nanof i ltration; alcohol precipitation

收稿日期:2018-05-08

基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(31401506)

第一作者简介:蔡铭(1979—)(ORCID: 0000-0003-0782-9877),男,副教授,博士,研究方向为植物源功能成分挖掘与利用。E-mail: caiming@zjut.edu.cn

*通信作者简介:孙培龙(1964—)(ORCID: 0000-0003-1963-1120),男,教授,博士,研究方向为食品化学与资源利用。E-mail: sun_pl@zjut.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180508-112

中图分类号:TS201.1

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2019)09-0083-08

引文格式:蔡铭, 陈思, 骆少磊, 等. 膜分离与醇沉技术纯化猴头菇粗多糖的比较[J]. 食品科学, 2019, 40(9): 83-90. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180508-112. http://www.spkx.net.cn

CAI Ming, CHEN Si, LUO Shaolei, et al. Comparison of membrane separation and alcohol precipitation for the separation of crude polysaccharides from Hericium erinaceus[J]. Food Science, 2019, 40(9): 83-90. (in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180508-112. http://www.spkx.net.cn