李果实皮薄多汁、酸甜可口、营养丰富,是我国重要的核果类水果之一[1-2],但李果实成熟于高温高湿的夏季,采前或采后都极易受到病原微生物的侵染而腐烂,从而造成巨大的经济损失[2-4]。其中,褐腐病是核果类果实采后主要的侵染性病害[5-6],该病的常见病原菌主要有:美澳型核果链核盘菌(Monilinia fructicola(Winter)Honey)、核果链核盘菌(Monilinia laxa(Aderh.et RuM.)Honey)和果生链核盘菌(Monilinia fructigena(Aderh.et RuM.)Honey)[7],而造成李果实褐腐病的主要致病菌是美澳型核果链核盘菌(M. fructicola)[4]。M. fructicola菌丝生长速度快,菌落呈现灰黄色的圆形同心轮纹;其分生孢子无色,形状为柠檬形或椭圆形,M. fructicola病原菌易侵染近成熟期或成熟期果实,可在成熟果实中快速定植,传播速度较快,易造成果实的腐烂[7-9]。李果实采后褐腐病的防治方式仍以化学杀菌剂为主[7],但由于化学杀菌剂会造成环境的污染、危害人类的健康以及促使病原菌产生抗性等一系列问题而受到应用限制[5]。目前,已有研究将一些安全且环保的杀菌剂替代品应用于李果实采后褐腐病的防治,例如:膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)[5]和巴西棕榈蜡(Copernicia cerifera wax)[10]在离体实验中均可抑制M. fructicola孢子的萌发和菌丝的生长,在果实实验中也可显著降低李果实的采后发病率等。但现阶段仍然需要寻找安全、环保的新型杀菌剂替代品来降低由褐腐病引起的采后李果实的烂果现象。
半胱氨酸作为一种公认的安全型氨基酸,常被用作鲜切水果和蔬菜的抗褐变保鲜剂[11]。近年来,半胱氨酸也被作为一种有效的外源处理应用于植物的抗逆境胁迫中,如L-半胱氨酸可以有效缓解镉胁迫对黄瓜种子的伤害[12],缓解盐胁迫对大麦种子的伤害[13]等;但却鲜有研究将L-半胱氨酸应用于采后果蔬侵染性病害控制方面。本研究目的在于揭示离体条件下L-半胱氨酸对李果实褐腐病病原菌M. fructicola可能的抑制机理以及其对李果实采后褐腐病害的防治效果,为采后果蔬病害控制研究提供新思路。
供试材料‘青脆李’(Prunus salicina Lindell cv.‘Qingcui’)采摘于重庆市北碚区缙云山果园,采摘后当天运回实验室。挑选无病害、无机械伤且大小均匀、成熟度一致的果实。摊平去除田间热后,于室温条件下贮藏待用。
褐腐病病原菌(M. fructicola)为本实验室自行分离、鉴定和保存的菌种。使用前将斜面保藏的菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar,PDA)培养基,并于25 ℃条件下培养5 d。在无菌条件下,用无菌水将M. fructicola洗下配制成高浓度的孢子悬浮液,并根据需要用无菌水调至到所需浓度,现配现用。
L-半胱氨酸(纯度>99%) 瑞士Adamas-Bata公司;SYTOX Green(SG)荧光染色试剂 美国Invitrogen Corp公司。
SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团安泰有限公司;BX43电子显微镜 日本Olympus公司;B203生物显微镜重庆奥特光学仪器有限公司;TS100荧光显微镜 北京长恒荣创科技有限公司;DDS-307A电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司;UV1000紫外分光光度计 北京莱伯泰科科技有限公司;AvantiTM J-30I高速冷冻离心机 美国Beckman公司;WD-9405B水平摇床 北京市六一仪器厂。
1.3.1 L-半胱氨酸处理对M. fructicola孢子萌发率的影响
培养基配制及孢子萌发实验参考赵一洁等[14]的方法,略有修改。将L-半胱氨酸溶于无菌水配制成质量浓度为10 000 mg/L的母液,在无菌条件下将其梯度稀释成10、100、1 000 mg/L,并在无菌条件下各取10 mL质量浓度为10、100、1 000、10 000 mg/L L-半胱氨酸溶液,分别加入90 mL灭菌后冷却至50~55 ℃的PDA培养基中,充分摇匀制成L-半胱氨酸终质量浓度为1、10、100、1 000 mg/L的培养基,以添加10 mL无菌水的PDA培养基作为对照组。
取灭菌的载玻片,将其置于含不同质量浓度L-半胱氨酸的培养基中,待其表面形成琼脂薄层后取出并去掉一面的琼脂培养基。用微量移液枪移取10 μL 1h106 个/mL的M. fructicola孢子悬浮液滴于含琼脂培养基的载玻片中间部位,之后平放于培养皿内的“U”形玻璃棒上,25 ℃保湿保温培养4 h后在电子显微镜下观察各组M. fructicola孢子的萌发情况,每次观察,孢子个数不少于150 个,实验重复3 次。按照式(1)计算孢子萌发率。
1.3.2 L-半胱氨酸处理对M. fructicola菌丝体的作用
含L-半胱氨酸的PDA培养基配制方法如1.3.1节。菌落直径的测定参考Zhang Zhanquan等[15]的方法,并略有修改。将配制好的含不同质量浓度L-半胱氨酸溶液的PDA培养基倒入平板中,待培养基凝固后,在平板中间接种已培养了5 d且取自M. fructicola菌落边缘直径为6 mm的菌饼。将接种后的平板置于25 ℃恒温箱中培养,每天观察其菌丝的生长状况(本研究只列出2、4 d的数据),并用十字交叉法测定菌落直径。实验重复3 次。
1.3.3 L-半胱氨酸处理对M. fructicola菌丝胞外电导率的影响
菌丝体的培养及胞外电导率的测定参考Wang Wenjun等[16]的方法,略有修改。采用电导率仪测定L-半胱氨酸对M. fructicola胞外电导率的影响。菌丝体的培养:将1h106 个/mL的M. fructicola孢子悬浮液接种于20 mL PDB培养基中,将其置于培养条件为25 ℃、 160 r/min的摇床中振荡培养48 h。
将培养48 h且含菌丝体的PDB培养基在4 000 r/min的条件下离心15 min,获得的菌丝体沉淀再在相同离心条件下用无菌水离心冲洗3 次。收集离心冲洗过后的菌丝体沉淀重新悬浮于无菌水中,之后加入L-半胱氨酸溶液使其终质量浓度分别为1、10、100、1 000 mg/L。将其继续放入摇床中进行培养,并测定摇床培养处理0、2、4、6、8 h时的胞外电导率,实验重复3 次。用无菌水作为对照组。
1.3.4 L-半胱氨酸处理对M. fructicola菌丝胞内核酸物质释放的影响
菌丝体的培养方法同1.3.3节。胞内核酸物质泄漏量的测定参考Tao Nengguo等[17]的方法,略有修改。将培养48 h且含菌丝体的PDB培养基在4 000 r/min离心15 min后用磷酸缓冲液(pH 7.0)冲洗3 次。收集离心过后的菌丝体沉淀重新悬浮于磷酸缓冲液(pH 7.0)中,之后加入L-半胱氨酸溶液使其终质量浓度分别为1、10、100、1 000 mg/L。将其继续放于培养条件为25 ℃、 160 r/min的摇床中振荡培养,在摇床培养处理0、2、4、6、8 h时离心,并用紫外分光光度计测定260 nm波长处上清液的吸光度,且其吸光度的大小与细胞质内核酸物质的释放量成正比。吸光度越大,表示L-半胱氨酸处理后M. fructicola菌丝胞内核酸物质释放量增多。实验重复3 次。用无菌水作为对照组。
1.3.5 L-半胱氨酸处理对M. fructicola孢子细胞膜完整性的影响
M. fructicola孢子细胞膜完整性的测定参考Olmedo等[18]的方法,略有修改。取5 支1.5 mL的无菌离心管,分别加入90 μL 1h107 个/mL M. fructicola孢子悬浮液,再分别加入10 μL质量浓度为10、100、1 000、10 000 mg/L L-半胱氨酸溶液,使其在100 μL混合液体中的终质量浓度分别为1、10、100、1 000 mg/L。以添加10 μL的无菌水作为对照组,将其置于25 ℃静态培养4 h,加入SG试剂贮备溶液使混合液中SG的终浓度为0.2 μmol/L,制片并在荧光显微镜下观察。实验重复3 次。每张载玻片随机选择5 个视野,且在明视野以及相同位置的荧光视野下分别拍照记录。将明视野中观察到的孢子数定义为总数(T),荧光视野下观察到绿色的染色孢子作为已被破坏膜结构的孢子数(S)。按照公式(2)计算细胞膜完整性。
1.3.6 L-半胱氨酸处理对采后李果实损伤接种M. fructicola的作用效果
参考Wang Liting等[19]的方法,略有修改。用体积分数2%次氯酸钠浸泡果实1 min后用清水冲洗,并于常温(20 ℃)下自然晾干。果实表面赤道部位经体积分数75%酒精擦拭消毒,之后将其随机分成5 组,每组10 个果实。用灭菌铁钉在果实赤道部位等距离打2 个孔(深3 mm、直径3 mm)。每个伤口加入10 μL 1h104 个/mL的M. fructicola孢子悬浮液。2 h后,在5 组果实的每个伤口处分别加入20 μL的0(无菌水,对照)、1、10、100、1 000 mg/L L-半胱氨酸溶液。待完全吸收后,单果包装,并于20 ℃、相对湿度80%~90%的条件下贮藏。每天统计发病率和病斑直径(本研究仅列出5、6、7 d的数据)。实验重复3 次。
Excel 2016软件统计分析数据,运用GraphPad Prism 7、Adobe Photoshop CS6软件绘制图表。应用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析,利用Duncan’s多重比较进行显著性分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。
图1 L半胱氨酸处理对M. fructicola孢子萌发的影响
Fig.1 Effect of L-cysteine treatment on spore germination rate of M. fructicola
如图1A所示,在培养4 h时,1 000 mg/L L-半胱氨酸处理可显著降低M. fructicola孢子的萌发率(P<0.05),且萌发率比对照组低36.7%。但1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组的孢子萌发率与对照组无显著性差异(P>0.05)。同时,从图1B中可以看出,在培养4 h时,1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组及对照组的M. fructicola孢子已大部分萌发,而1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组的M. fructicola孢子萌发数较少。
如图2A所示,M. fructicola菌落直径在含不同质量浓度L-半胱氨酸的培养基中均随着培养时间的延长呈上升的趋势。在培养2、4 d时,1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组与对照组相比可以显著抑制M. fructicola菌丝的生长(P<0.05),但1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组菌落直径与对照组相比没有显著性差异(P>0.05)。图2B为培养4 d时,M. fructicola菌丝生长情况的照片,可以看出1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组与对照组的M. fructicola菌丝已基本长满培养基表面,而1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组的M. fructicola菌丝仅在菌饼周围生长。
图2 L-半胱氨酸处理对M. fructicola菌丝体生长的影响
Fig.2 Effect of L-cysteine treatment on mycelial growth of M. fructicola
图3 L-半胱氨酸处理对M. fructicola菌丝胞外电导率的影响
Fig.3 Effect of L-cysteine treatment on extracellular conductivity of M. fructicola
由图3可知,M. fructicola菌丝体电导率随处理时间的延长呈现上升趋势。1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组的胞外电导率在处理2、4、8 h时与对照组相比无显著性差异(P>0.05),而在处理6 h时,10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组的胞外电导率显著高于对照组(P<0.05)。1 000 mg/L L-半胱氨酸处理后,M. fructicola菌丝胞外电导率都极显著高于对照组(P<0.01)。在处理2、4、6、8 h时,1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组的电导率分别为对照组的2.16、2.27、2.30、1.45倍。
图4 L-半胱氨酸处理对M. fructicola菌丝胞内核酸物质释放的影响
Fig.4 Effect of L-cysteine treatment on the release of intracellular constituents from M. fructicola
由图4可知,在处理0~8 h内,0、1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组的OD260 nm变化不明显,且1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组的OD260 nm与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。而1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组的OD260 nm随着处理时间的延长呈现上升趋势,并且极显著高于对照组(P<0.01),在处理2、4、6、8 h时,1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组的OD260 nm分别为对照组的2.11、2.29、2.54、2.37 倍。
图5 L-半胱氨酸处理对M. fructicola细胞膜完整性的影响
Fig.5 Effect of L-cysteine treatment on membrane integrity in spores of M. fructicola
如图5A所示,通过SG荧光染色剂和荧光显微镜观察L-半胱氨酸处理4 h对M. fructicola孢子细胞膜的破坏能力。结果发现,对照组及1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组发出绿色SG荧光的M. fructicola孢子数相对较少,但经1 000 mg/L L-半胱氨酸处理的M. fructicola孢子发出绿色SG荧光的孢子数明显增多。且由图5B可知,对照组以及1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组的M. fructicola孢子的细胞膜完整性保持在84%以上,而1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组的M. fructicola孢子的细胞膜完整性降低至73%左右,与对照组相比差异显著(P<0.05)。
图6 L-半胱氨酸处理对李果实褐腐病发病率(A)和病斑直径(B)的影响
Fig.6 Effect of L-cysteine treatment on disease incidence (A) and lesion diameter (B) of M. fructicola in plums during storage
如图6所示,李果实的褐腐病发病率及病斑直径随贮藏时间的延长呈现上升趋势。在贮藏5~6 d时,1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组与对照组相比显著降低了李果实损伤接种褐腐病的发病率(P<0.05);同时,在贮藏5~7 d,1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组与对照组相比显著降低了李果实褐腐病的病斑直径(P<0.05)。1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理组在整个贮藏期内无论是发病率还是病斑直径与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。
本实验主要探讨了L-半胱氨酸处理在离体条件下对褐腐病病原菌M. fructicola孢子及菌丝生长的影响,进而探究了其在果实病害控制实验中的作用效果。结果表明,与L-谷氨酸在离体条件下对扩展青霉(Penicillium expansum)、链格孢(Alternaria alternate)及指状青霉(Penicillium digitatum)无直接抑制作用的结果不同[20],L-半胱氨酸在离体条件下对李果实褐腐病病原菌M. fructicola具有一定的抑制作用,但不同质量浓度L-半胱氨酸处理对李果实M. fructicola的抑制情况存在明显的差异。在前期实验中探究了0、1、10、100、300、500、700、1 000 mg/L L-半胱氨酸在离体条件下对M. fructicola孢子萌发及菌丝生长的影响(数据未呈现),结果显示500、700、1 000 mg/L L-半胱氨酸均可延缓病原菌孢子的萌发,抑制菌丝体的生长,并且随着L-半胱氨酸处理质量浓度增大,其对M. fructicola的生长抑制效果增强,其中1 000 mg/L L-半胱氨酸处理组抑制效果最强。这与壳聚糖[21]、柠檬酸[22]、β-氨基丁酸[23]等在离体条件下对病原菌的抑菌作用与质量浓度成正比的结果相似。在本实验的4 个处理质量浓度中,与对照组相比,只有1 000 mg/L L-半胱氨酸处理可以显著延缓M. fructicola孢子的萌发,明显破坏M. fructicola孢子细胞膜,使SG荧光染色剂进入孢子内与核酸物质结合,从而使较多的孢子发出荧光。细胞膜是细胞与周围环境进行物质交换和信息传递的通道和屏障[24],它的通透性和完整性在细胞进行正常生理活动中具有重要的作用[25]。细胞膜通透性的异常变化会导致细胞内含物的大量泄露从而影响细胞的正常生理活性,这也是细胞损伤的早期表现[26-27]。1 000 mg/L L-半胱氨酸处理可显著增加菌丝体胞外电导率,促使其菌丝体膜内物质的泄漏,说明菌丝体的细胞膜在一定程度上受到了破坏,这与一些精油物质[28-29]及萜类化合物[30]抑制真菌病原菌生长的离体实验结果相似。在果实实验中,青脆李果实经1 000 mg/L L-半胱氨酸处理后的发病率和病斑直径与对照组相比有显著性差异;与离体实验结果相似,1、10、100 mg/L L-半胱氨酸处理对李果实采后褐腐病害并无显著控制效果。同样,β-氨基丁酸处理接种绿霉病病原菌的苹果果实[23]与壳寡糖处理接种黑斑病病原菌的枣果实[19]也存在离体和果实实验有效浓度相一致的现象。
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Inhibitory Effect of L-Cysteine against Monilinia fructicola on Postharvest Plum Fruit
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