统计资料表明，我国目前有半数以上的人群处于经常疲劳的状态，在城市人口中已占70%[1]。氧化应激损伤是疲劳产生的主要原因之一[2-5]，以保护机体氧化损伤为靶点的抗疲劳产品，尤其是中药抗疲劳保健食品日益受到人们的关注。五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill）是木兰科植物五味子的干燥成熟果实，其主要活性成分为多糖、木脂素等[6-7]。目前，关于五味子多糖具有抗疲劳及耐缺氧作用的报道较多[8-10]，而五味子木脂素的相关研究较少。前期研究发现，五味子总木脂素能显著提高小鼠的抗疲劳能力[11-12]，但其中发挥主要作用的活性成分并未知晓。五味子酯甲（schisantherin A，SCA）是五味子木脂素的主要单体化合物成分，已有研究证实SCA具有较强的抗氧化功能[13-15]，但关于其抗疲劳作用的研究鲜有报道。本实验通过观察SCA对小鼠的抗疲劳作用及其与Nrf2/ARE抗氧化通路的相关机制，以验证五味子总木脂素抗疲劳作用的主要活性成分，为开发辅助抗疲劳功能的药物及保健食品提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
ICR小鼠，雄性，体质量（19f 2）g，吉林大学实验动物研究中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（吉）-2016-0003。
SCA 四川省维克奇生物科技有限公司；吐温20（分析纯） 天津永大试剂公司；血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）试剂盒、乳酸（lactic acid，LA）试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒、肌酸激酶（creatine kinase，CK）试剂盒、肝糖原（liver glycogen，LG）试剂盒、肌糖原（muscle glycogen，MG）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG）试剂盒 南京建成生物工程研究所；HCl-Tris、过硫酸铵、30%丙烯酰胺、甘氨酸、四甲基乙二胺 北京鼎国试剂公司；脱脂奶粉 美国BD公司；Keap1、Nrf2、HO-1 武汉ABclone公司；电化学发光（electro-chemiluminescence，ECL）显色液 美国Vazyme公司。
1.2 仪器与设备
Western blot凝胶电泳仪、转膜仪 美国Bio-Rad 公司；全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统 北京赛智创业科技有限公司；infinite M200全自动酶标仪 瑞士TECAN集团。
1.3 方法
1.3.1 动物分组及给药
将120 只ICR小鼠随机分为4 组：CON组：蒸馏水灌胃及静坐实验；MOD组：蒸馏水灌胃及负重游泳训练；SCA（C）组：SCA（2.5 mg/kg）灌胃及静坐实验； SCA（M）组：SCA（2.5 mg/kg）灌胃及负重游泳训练。各组小鼠每天给药1 次（0.1 mL/10 g）。
1.3.2 动物造模方案
静坐实验，不施加其他外界刺激干扰，不进行运动训练，保持小鼠正常活动状态。负重游泳训练，将小鼠置于（15f 2）℃、水面高度20 cm的塑料容器中，第一天30 min，第二天45 min，然后，每天60 min，每周训练5 d。游泳训练第2～6周每天保持1 h，负重为体质量的10%。每周称量体质量，并且相应地增加负荷。
1.3.3 小鼠负重游泳实验
在末次给予药物30 min之后，进行负重游泳实验（方法同1.3.2节），至小鼠沉于水面下10 s后不能浮出水面的时间作为力竭游泳时间[16]。
1.3.4 小鼠疲劳转棒实验
在末次给予药物30 min之后，进行疲劳转棒实验（转速30 r/min）。正式实验前进行适应性训练3 次，开始记录小鼠由于肌肉疲劳产生后，从转棒上跌下的时间[17]。
1.3.5 SCA对小鼠体内疲劳相关生化指标的测定
在末次给予药物30 min之后，小鼠不负重游泳60 min（温度（15f 2）℃），休息60 min后进行摘眼球取血，制备血清。采血后即刻取小鼠的肝脏，用生理盐水漂洗后滤纸吸干，备用。检测血清中BUN、LA、LDH、CK的水平以及肝脏、肌肉中LG、MG的含量。
1.3.6 SCA对小鼠体内氧化相关生化指标的测定
取1.3.5节中制备的血清，按照试剂盒提供的方法检测MDA、8-OHdG水平和SOD、GSH-Px活力。
1.3.7 Western blot法检测血清中Keap1、Nrf2及HO-1的表达情况
在末次给予药物30 min之后，小鼠不负重游泳60 min（温度（15f 2）℃），休息60 min后，每组取3 只小鼠肝组织，冰上加入裂解液裂解1 h，离心后取上清液。测定肝组织蛋白浓度（二喹啉甲酸法[18]），十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离Keap1、Nrf2、HO-1蛋白。电转移至偏聚氟乙烯膜（2 h），封闭1 h（含质量分数5%脱脂奶粉的TBST缓冲液）。室温孵育后弃去封闭液，分别加入一抗Keap1（1∶1 000）、Nrf2（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000），4 ℃温育过夜后使用TBST洗5 次，每次5 min。二抗（1∶2 000）室温温育1 h，TBST洗5 次，每次5 min，ECL显影液显色。
1.4 数据统计分析
使用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验数据用
s表示，组间差异性比较采用t检验。
2 结果与分析
2.1 负重游泳实验和转棒实验观察SCA对小鼠运动耐力的影响
负重游泳实验结果显示（图1A），与CON组相比，MOD组小鼠负重游泳时间极显著缩短（P＜0.01），SCA（C）组小鼠负重游泳时间显著延长（P＜0.05）；与MOD比较，SCA（M）组小鼠负重游泳时间显著延长（P＜0.05）。如图1B所示，转棒实验中，与CON组相比，MOD转棒时间极显著缩短（P＜0.01），SCA（C）组小鼠转棒时间显著延长（P＜0.05），与MOD组比较， SCA（M）组小鼠转棒时间显著延长（P＜0.05）。
图 1 负重游泳实验（A）和转棒实验（B）观察SCA对小鼠运动耐力的影响（n＝ 15）
Fig. 1 Effect of SCA on exercise endurance in mice by weight-bearing swimming test (A) and rotarod test (B) (n = 15)
2.2 SCA对小鼠血清中BUN、LA浓度，LDH、CK活力以及肝脏与肌肉组织中LG、MG含量的影响
图 2 SCA对疲劳小鼠血清中BUN（A）、LA（B）、LDH（C）、CK（D）水平的影响（n＝ 15）
Fig. 2 Effect of SCA on the levels of BUN (A), LA (B), LDH (C) and CK (D) in serum of fatigue mice (n =15)
小鼠血清中B U N 浓度结果显示（图2 A），与CON组相比，MOD组小鼠血清BUN浓度极显著增加 （P＜0.01），SCA（C）组小鼠血清BUN浓度显著降低（P＜0.05）；与MOD组相比，SCA（M）组小鼠血清BUN浓度显著降低（P＜0.05）。对各组小鼠血清LA浓度检测结果显示（图2B），与CON组相比，MOD组小鼠血清中LA浓度显著增加（P＜0.05），SCA（C）组小鼠血清LA浓度降低，无统计学差异；与MOD组相比，SCA（M）组小鼠血清LA浓度极显著下降（P＜0.01）。对各组小鼠血清LDH活力检测结果显示（图2C），与CON组相比，MOD组小鼠血清中LDH活力显著升高 （P＜0.05），SCA（C）组小鼠血清LDH活力降低，但无统计学差异；与MOD组相比，SCA（M）组小鼠血清LDH活力显著下降（P＜0.05）。对各组小鼠血清CK活力检测结果显示（图2D），与CON组相比，MOD组小鼠血清CK活力升高（P＜0.05），SCA（C）组小鼠血清CK活力极显著降低（P＜0.01）；与MOD组相比， SCA（M）组小鼠血清CK活力显著降低（P＜0.05）。
图 3 SCA对疲劳小鼠肝组织及肌肉组织中LG（A）及 MG（B）含量的影响（n＝ 15）
Fig. 3 Effect of SCA on the contents of LG (A) and MG (B) in liver and muscle tissues of fatigue mice (n = 15)
由图3A可知，与CON组相比，MOD组小鼠LG含量显著降低（P＜0.05），SCA（C）组小鼠LG含量极显著升高（P＜0.01）；与MOD组相比，SCA（M）组小鼠LG含量极显著升高（P＜0.01）。对肌肉组织中MG含量检测结果显示（图3B），与CON组相比，MOD组小鼠MG含量显著降低（P＜0.05），SCA（C）组小鼠MG含量无统计学差异；与MOD组相比，SCA（M）组小鼠MG含量显著升高（P＜0.05）。
2.3 SCA对小鼠血清中SOD、GSH-Px活力及MDA、8-OHdG水平的影响
图 4 SCA对疲劳小鼠血清中SOD（A）、MDA（B）、GSH-Px（C）、8-OHdG（D）水平的影响（n=15）
Fig. 4 Effect of SCA on the levels of SOD (A), MDA (B), GSH-Px (C), and 8-OHdG (D) in serum of fatigue mice (n = 15)
由图4A可知，与CON组相比，MOD组小鼠血清中SOD活力极显著下降（P＜0.01），SCA（C）组小鼠血清中SOD活力升高，但无统计学差异；与MOD组相比，SCA（M）组小鼠血清中SOD活力极显著升高 （P＜0.01）。各组小鼠血清中MDA浓度检测结果显示（图4B），与CON相比，MOD组小鼠血清中MDA浓度极显著升高（P＜0.01），SCA（C）组小鼠血清中MDA浓度降低，无统计学差异；与MOD组相比，SCA（M） 组小鼠血清中MDA浓度显著降低（P＜0.05）。各组小鼠血清中GSH-Px活力检测结果显示（图4C），与CON组相比，MOD组小鼠血清中GSH-Px活力降低，但无统计学差异，SCA（C）组小鼠血清中GSH-Px活力显著升高（P＜0.05）；与MOD组相比，SCA（M）组小鼠血清中GSH-Px活力显著升高（P＜0.05）。各组小鼠血清中8-OHdG质量浓度检测结果显示（图4D），与CON组相比，MOD组小鼠血清中8-OHdG质量浓度显著升高 （P＜0.05），SCA（C）组小鼠血清中8-OHdG质量浓度显著降低（P＜0.05）；与MOD组相比，SCA（M）组小鼠血清中8-OHdG质量浓度显著降低（P＜0.05）。上述结果提示SCA可能通过提高小鼠机体的抗氧化能力而发挥抗疲劳作用。
2.4 SCA对疲劳小鼠肝组织中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达影响
图 5 SCA对疲劳小鼠肝组织中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达的 影响（n＝ 3）
Fig. 5 Effect of SCA on the expression of Keap1, Nrf2 and HO-1 proteins in liver tissue of fatigue mice (n = 3)
本研究应用Western blot方法从蛋白水平观察各组小鼠Keap1、Nrf2、HO-1的表达情况。Western blot结果如图5所示，与CON组相比，MOD组小鼠肝组织Keap1蛋白表达水平上升，Nrf2、HO-1蛋白表达水平极显著下降（P＜0.01）；SCA（C）组小鼠Keap1蛋白表达水平极显著下降（P＜0.01），Nrf2、HO-1蛋白表达水平极显著上升（P＜0.01）；与MOD组相比，SCA（M）组Keap1蛋白表达水平极显著下降（P＜0.01），Nrf2、HO-1蛋白表达水平极显著上升（P＜0.01）。进一步验证了SCA有可能通过影响Keap1/Nrf2/ARE信号通路中Keap1、Nrf2、HO-1表达而发挥相关作用。
3 讨 论
运动耐力是评价受试动物疲劳程度的重要指标[19-20]。本研究应用负重游泳及疲劳转棒实验两种方法观察SCA对小鼠运动耐力的影响。实验设立慢性疲劳模型SCA给药组，即SCA（M）组，通过持续28 d的冷水负重游泳训练致小鼠慢性疲劳，用以对照观察SCA给药对小鼠慢性疲劳的影响；此外，本实验另设SCA未训练鼠给药组即SCA（C）组，旨在观察SCA对急性运动疲劳小鼠运动耐力的影响。实验结果显示，无论在负重游泳实验还是疲劳转棒实验中，SCA（M）及SCA（C）组小鼠均表现出明显的机体抗疲劳作用，提示SCA能够提高慢性疲劳及急性疲劳小鼠的运动耐力。
BUN的浓度反映了蛋白质分解代谢和身体对运动的耐受性，在剧烈运动的过程中，有氧能量供应变为肌肉中的无氧糖酵解，肌糖原被迅速消耗，产生大量的LA。LA在肌肉和血液中的累积会导致肌肉疲劳，而血清中LDH、CK的水平反映机体运动肌肉损伤的程度。MG在运动中直接提供能量，LG储备能量，它们的氧化产物是运动能量的主要来源[21]。本研究结果显示，SCA（M）组小鼠（与MOD组比较）及SCA（C）组小鼠（与CON组比较）血清BUN、LA、LDH及CK的水平均明显降低，而肝糖原、肌糖原的浓度明显增加。血清中LDH和CK的水平显著降低，表明可能是由于SCA在强烈运动期间保护细胞免受损伤，且SCA加快了乳酸的分解，降低BUN浓度，延缓了疲劳的发生。MG与LG的含量增加为运动提供了更多的能量。进一步证实SCA具有抗疲劳作用。
小鼠的剧烈运动加速自由基的产生，并诱发氧化应激损伤[22-24]。SOD是最主要的抗氧化酶，在机体氧化与抗氧化平衡中起重要的作用；MDA是脂质过氧化的产物，是反应自由基所致的机体损伤的重要指标，其在血清中的含量随着机体的疲劳累积而升高；GSH-Px作为机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，能够催化GSH变为GSSG，还原有毒的过氧化物变为无毒的羟基化合物，进而保护细胞不受过氧化物的损伤；8-OHdG可以反映机体细胞DNA氧化损伤的程度，该值越高提示DNA氧化损伤越严重[25-27]。本实验结果显示，SCA可以提高疲劳小鼠血清中SOD、GSH-Px的活力，降低MDA、8-OHdG水平，提示SCA在慢性疲劳小鼠及急性疲劳小鼠中都表现出显著的抗氧化作用，该结果与其他研究酯甲抗氧化功能的结果[28]是一致的。
Nrf2/ARE信号通路是参与机体抗氧化反应的重要调节通路，Nrf2是细胞氧化的关键调节因子[29]。据报道，Nrf2缺陷小鼠表现出对肝脏组织中氧化应激的极端易感性，通过改善体内Nrf2的活性，可以有效地对抗氧化应激损伤，进而减轻疲劳[30-31]。Keap1是Nrf2负调控因子，其自身的泛素化、磷酸化以及核穿梭机制都能影响Nrf2的活力[32]。HO-1是体内较强的抗氧化剂，受Nrf2调控[33-34]。 本研究显示SCA能够下调慢性疲劳小鼠肝脏组织中Keap1蛋白的表达，并上调Nrf2、HO-1蛋白的表达，提示SCA可能通过调节Nrf2/ARE信号通路减轻氧化应激以产生抗疲劳作用。后续研究将继续探讨SCA对肝脏以外其他组织中Nrf2/ARE信号通路的影响，以进一步探明SCA抗疲劳作用机制。
综上，SCA对小鼠具有显著的抗疲劳作用。该作用可能与其提高小鼠能量储备、抗氧化能力及调节肝脏Nrf2/ARE抗氧化通路有关。
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