蛹虫草（Cordyceps militaris（L.）Link）又称北虫草，是少数可以规模化生产的食用真菌之一，也是我国最常见、分布最广、药用价值极高的一种虫草菌[1]。蛹虫草中的主要活性成分蛹虫草多糖具有抑制肿瘤、抗炎症、抗病毒、抑菌、调节免疫等功能[2-4]。多数研究认为蛹虫草多糖对肝脏的保护作用主要是通过提高机体的抗脂质过氧化能力、改善人体细胞免疫和体液免疫及提高巨噬细胞的吞噬功能实现[5-9]。
发酵型酸奶有提高自由基清除能力、过氧化物清除能力，降低血清胆固醇水平的功效[11-13]。蔡宇[14]、朱蕴兰[15]等利用蛹虫草菌丝体及发酵液研制了一种功能性酸奶饮料。
随着我国居民饮酒频率和脂肪摄入量增加，酒精性肝损伤成为除病毒性肝炎之外的另一个重要危险因素[16]。而蛹虫草多糖酸奶对酒精性肝损伤协同保护作用的研究鲜有报道。因此，本实验通过蛹虫草液态发酵获得蛹虫草胞外多糖，以添加蛹虫草胞外多糖及保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌3 种混菌发酵的酸奶为研究对象，灌胃酒精模型小鼠。通过生化指标的变化分析蛹虫草多糖酸奶对小鼠酒精性肝损伤的协同保护作用，为开发蛹虫草多糖功能性乳制品提供数据支持和理论指导。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
健康雄性昆明小鼠56 只，体质量（20f 2）g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2018-0003。
蛹虫草菌种，由山东农业大学生命科学学院提供；植物乳杆菌发酵剂 常州益菌加生物科技有限公司；脱脂乳粉 澳大利亚迈高乳业公司。
联苯双酯滴丸 万邦德制药集团股份有限公司；谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）测试盒、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）测试盒、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测试盒、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）测试盒、甘油三酯（triglyceride，TG）测试盒、总胆固醇（total cholesterol，TC）测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测试盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒 南京建成生物工程研究所。其余试剂均为分析纯。
PDA固体培养基：土豆20%（质量分数，下同）、琼脂粉2%、葡萄糖2%、K2HPO4 0.15%、MgSO4 0.10%，121 ℃灭菌20 min。
蛹虫草液体培养基：土豆2 0%、葡萄糖2%、K2HPO4 0.15%、MgSO4 0.10%，121 ℃灭菌20 min[17]。
1.2 仪器与设备
SMP500-17805-2BF0酶标仪 上海闪谱生物科技公司； TDZ5-WS台式多管自动平衡离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；SW-CJ-1CU洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；RE52CS-1旋转蒸发仪 上海亚荣有限公司； 1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司；RM2135石蜡切片机 德国Leica公司；HMIAS-2000高清晰彩色医学图文分析系统 武汉千屏影像技术有限公司；YD-A型摊片机、YD-6L型冷冻工作台、YD-6L型全自动生物组织包埋机 浙江金华益迪医疗设备厂。
1.3 方法
1.3.1 蛹虫草多糖提取
蛹虫草菌种在PDA固体培养基中活化，在无菌条件下接种到灭菌的蛹虫草液体培养基中，25 ℃培养5～7 d，摇床转速为150 r/min，抽滤；滤液经过旋转蒸发浓缩至原体积1/5；用体积分数95%乙醇溶液4 ℃醇析24 h，3 800 r/min离心，获得粗多糖；溶解至一定体积水中，以1/4体积量加入Sevag液（氯仿-正丁醇体积比4∶1），去蛋白；多糖溶液醇析24 h，3 800 r/min离心，获得脱蛋白多糖；Sephadex G-100柱过滤层析，得到蛹虫草多糖纯品[18]。
1.3.2 蛹虫草多糖的分子质量测定
采用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）测定蛹虫草的重均分子质量（weight-average molecular weights，Mw）、数均分子质量（numberaverage molecular weights，Mn）和平均分子质量（z-average molecular weight，Mz）[18]。
1.3.3 蛹虫草多糖的基本指标测定
使用苯酚-硫酸法测定蛹虫草多糖的总糖质量分数，用Bradford的方法测定蛋白质量分数，通过间羟基二苯基比色法测定糖醛酸质量分数[18]。
1.3.4 蛹虫草多糖酸奶的配制
加入13%（质量分数，下同）脱脂乳粉、6%蔗糖，蛹虫草多糖质量分数分别为0、0.03%、0.06%、0.12%，95 ℃水浴15 min进行巴氏杀菌，待冷却至42 ℃，接种0.1%发酵菌粉（植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌接种质量比为3∶1∶1），制备蛹虫草多糖益生菌酸奶，41 ℃恒温培养发酵6 h，后熟12 h，4 ℃贮存备用[19]。
1.3.5 动物分组及给药
小鼠随机分7 组，每组8 只，适应性喂养3 d后，除空白对照组外，各组每天灌胃150 mg/kg mb体积分数40%乙醇溶液，建立小鼠酒精性肝损伤模型。每日灌胃相应样品，共给药28 d，期间供给颗粒饲料，不限制饮食饮水。分组及给药剂量如表1所示。
表 1 各组小鼠的基本给药情况（n＝8）
Table 1 Administration scheme for mice in each group (n= 8)
组别 喂养处理 给药情况 给药剂量/（mg/（kg mbg d））空白对照组 0.9%生理盐水 0.9%生理盐水 150模型组 40%乙醇 0.9%生理盐水 150酸奶对照组 40%乙醇 发酵酸奶 150低剂量组 40%乙醇 蛹虫草多糖添加量0.03%酸奶 150中剂量组 40%乙醇 蛹虫草多糖添加量0.06%酸奶 150高剂量组 40%乙醇 蛹虫草多糖添加量0.12%酸奶 150阳性对照组 40%乙醇 联苯双酯 150
1.3.6 检测方法及检测指标
1.3.6.1 一般情况观察
实验期间观察小鼠的体质量变化、进食、状态、毛发及死亡情况。
1.3.6.2 小鼠肝脏指数测定
小鼠肝脏指数根据下式计算。
1.3.6.3 小鼠血清的制备
小鼠眼球取血置于离心管中，放置30 min，3 800 r/min离心10 min，取上清液，4 ℃保存备用。
1.3.6.4 血液中生化指标的测定按照试剂盒说明测定血清ALT、AST、LDL-C和HDL-C，测量血浆TG和TC水平[20]。
1.3.6.5 小鼠肝脏组织匀浆的制备
小鼠脱颈处死，迅速刨出肝脏组织用预冷的生理盐水洗去残留血，滤纸拭干，称质量。按1∶9（m/V）比例制成10%组织匀浆液，4 ℃条件贮存备用[21]。
1.3.6.6 肝脏组织中生化指标的测定
按照试剂盒说明测定SOD、GSH-Px活力及MDA含量。采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
1.3.6.7 病理学切片的制作
质量分数4%多聚甲醛中固定24 h，脱水透明处理，制作石蜡切片，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光学显微镜下观察肝组织切片的病理形态学变化[22]。
1.4 数据统计分析
数据采用SPSS 19.0软件包完成统计分析，结果以平均值±标准差表示，组间差异显著性比较采用单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 蛹虫草多糖的分子质量
蛹虫草多糖M w、M n和M z分别为2.5 8 h 1 03、1.95h 103、3.15h 103 Da，Mw/Mn为1.32。
2.2 蛹虫草多糖的基本指标
蛹虫草多糖的总糖质量分数、蛋白质量分数、糖醛酸质量分数分别为（8 4.0 2 f 3.7 5）%、（3.18f 0.12）%、（17.65f 0.07）%。
2.3 蛹虫草多糖酸奶对酒精性肝损伤小鼠体质量和肝脏指数的影响
乙醇灌胃小鼠后，小鼠均表现出四肢瘫软等兴奋状态[22]。不同添加量（0.03%、0.06%、0.12%）蛹虫草多糖酸奶对小鼠体质量和肝脏指数的影响见表2，在空白对照组和模型组之间观察到体质量增长比例没有显著的变化。与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠肝脏指数显著提高了56.82%（P＜0.05），说明乙醇能够造成小鼠肝肿胀。与模型组相比，酸奶对照组，蛹虫草多糖低、中、高剂量酸奶组，阳性对照组小鼠肝脏指数分别降低3.38%、7.89%、13.21%、16.26%、25.93%。与酸奶对照组相比，高剂量蛹虫草多糖酸奶组肝脏指数显著下降13.13%（P＜0.05）。与阳性对照组相比，低、中、高剂量蛹虫草多糖酸奶组肝脏指数均有提高，分别提高24.35%、17.17%、13.04%。
表 2 蛹虫草多糖酸奶对小鼠体质量、肝脏指数的影响
Table 2 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on body mass and liver index in mice
注：同列肩标字母不同表示有显著性差异（P＜0.05）。下同。
组别 体质量增长比例/% 肝脏指数/%空白对照组 23.08f 1.64c 3.96f 0.14a模型组 24.13f 3.84c 6.21f 0.12d酸奶对照组 23.80f 1.80c 6.00f 0.36d低剂量组 7.16f 1.07a 5.72f 0.53cd中剂量组 12.19f 1.85b 5.39f 0.53c高剂量组 24.62f 4.24c 5.20f 0.31c阳性对照组 25.33f 1.36c 4.60f 0.36b
2.4 蛹虫草多糖酸奶对酒精性肝损伤小鼠肝功能的影响
在本研究中，模型组与空白对照组相比，模型组ALT、AST活力分别增加了91.84%、65.52%（表3），表明建模成功[23]。ALT和AST均为非特异性细胞内功能酶，在正常动物血清中的含量很低[24]，当肝细胞损伤时，肝细胞膜通透性增加，ALT、AST逸出细胞进入血浆使酶活力增高，是临床上常用的肝功能评价 指标[25]。所以ALT与AST活力可以在一定程度上反映生物体内肝细胞的损伤程度[26]。
表 3 蛹虫草多糖酸奶对小鼠血清AST、ALT活力的影响
Table 3 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on AST and ALT activities in serum of mice
组别 ALT活力/（U/L） AST活力/（U/L）空白对照组 36.75f 1.71b 87.00f 7.83ab模型组 70.50f 1.91f 144.00f 6.98e酸奶对照组 62.75f 3.77e 131.41f 3.02d低剂量组 47.00f 4.90d 111.58f 9.63c中剂量组 36.75f 1.50b 94.25f 4.79b高剂量组 29.00f 2.45a 88.00f 6.58ab阳性对照组 42.25f 2.50c 83.25f 3.77a
与模型组相比，酸奶对照组，蛹虫草多糖低、中、高剂量酸奶组，阳性对照组ALT活力分别显著降低10.99%、33.33%、47.87%、58.87%、40.07%，AST活力下降8.74%、22.51%、34.55%、38.89%、 42.19%（P＜0.05）。
未添加蛹虫草多糖的对照酸奶对肝功能有一定作用，与模型组相比，ALT、AST活力分别显著性降低10.99%、8.74%。而高剂量蛹虫草多糖酸奶效果更加明显，与模型组相比，ALT活力显著性降低58.87%，AST活力下降38.89%。说明蛹虫草多糖与植物乳杆菌能够协同提高肝功能。与阳性对照组相比，蛹虫草多糖高剂量酸奶组ALT活力显著降低31.36%，AST活力提高5.71%，高剂量多糖酸奶与联苯双酯同样对小鼠肝功能有很好的改善作用。
2.5 蛹虫草多糖酸奶对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂肪代谢的影响
表 4 蛹虫草多糖酸奶对小鼠血清TG、TC、HDL-C、 LDL-C浓度的影响
Table 4 Effect of yogurt with Cordyceps militaris polysaccharides on TG, TC, HDL-C and LDL-C contents in serum of mice
组别 TC浓度/（mmol/L）TG浓度/（mmol/L）LDL-C浓度/（mmol/L）HDL-C浓度/（mmol/L）空白对照组 3.60f 0.21a 1.50f 0.22a 0.23f 0.03c 1.72f 0.03a模型组 5.35f 0.27d 2.71f 0.32d 2.05f 0.06a 1.50f 0.06g酸奶对照组 5.09f 0.26d 2.59f 0.12d 1.84f 0.05a 1.52f 0.07f低剂量组 4.67f 0.29c 2.03f 0.18c 1.54f 0.05b 1.61f 0.05e中剂量组 4.24f 0.20b 1.81f 0.12bc 1.42f 0.06c 1.71f 0.05d高剂量组 3.91f 0.30ab 1.64f 0.16ab 1.26f 0.04d 1.81f 0.06c阳性对照组 3.65f 0.09a 1.56f 0.08ab 0.41f 0.07bc 1.68f 0.05b
小鼠经酒精连续灌胃28 d后，肝脏发生脂肪性病变，脂肪代谢能力下降，导致血液中TG、TC浓度上升[27]。模型组TG、TC浓度均明显高于空白对照组（P＜0.05），各样品处理组与模型组相比，TG、TC浓度均降低 （表4）。与模型组相比，酸奶对照组，蛹虫草多糖低、中、高剂量酸奶处理组，阳性对照组TG浓度分别下降4.43%、25.09%、33.21%、39.48%、42.44%，TC浓度分别下降4.86%、12.71%、20.75%、26.92%、31.78%。与阳性对照组相比，蛹虫草多糖高剂量酸奶处理组TG、TC浓度分别下降5.13%、7.12%。
HDL、LDL与胆固醇在体内的运输密切相关，HDL-C、LDL-C浓度会随着血液中TG浓度的变化而改变[28-30]。同对照组相比，模型组HDL-C浓度显著下降 （P＜0.05），LDL-C浓度显著上升（P＜0.05）。与模型组相比，蛹虫草多糖低、中、高剂量酸奶处理组，阳性对照组的LDL-C浓度分别降低10.24%、24.88%、30.73%、38.54%、80.00%，HDL-C浓度分别提高1.33%、7.33%、14%、20.67%、12.00%。与阳性对照组相比，蛹虫草多糖高剂量酸奶处理组，HDL-C浓度显著提高2.07 倍，LDL-C水平显著提高了7.74%。
未添加蛹虫草多糖的对照酸奶对脂肪代谢能力的提高有一定作用，与模型组相比，TG、TC、LDL-C浓度显著降低4.43%、4.86%、10.24%，HDL-C浓度提高1.33%。而高剂量蛹虫草多糖酸奶与模型组相比，TG、TC、LDL-C浓度分别显著降低39.48%、26.92%、38.54%，HDL-C含量显著提高20.67%，蛹虫草多糖与植物乳杆菌能够协同提高脂肪代谢能力。高剂量多糖酸奶与联苯双酯都对小鼠肝脏脂肪代谢有很好的促进作用。
2.6 蛹虫草多糖酸奶对酒精性肝损伤小鼠肝脏抗氧化能力的影响
表 5 蛹虫草多糖酸奶对小鼠肝脏SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影响
Table 5 Effect of yoghurt with Cordyceps militaris polysaccharides on SOD and GSH-Px activities and MDA level in liver of mice
组别 GSH-Px活力/（U/mg pro）SOD活力/（U/mg pro）MDA含量/（nmol/mg pro）空白对照组 953.94f 21.33g 294.14f 17.42a 2.75f 0.13d模型组 560.57f 51.20a 220.70f 41.80d 3.47f 0.23e酸奶对照组 603.39f 41.10b 224.90f 33.56d 3.30f 0.14e低剂量组 661.73f 27.59c 248.63f 22.53c 2.45f 0.21c中剂量组 749.34f 17.48d 259.63f 14.27b 1.85f 0.17b高剂量组 863.01f 5.10f 276.23f 4.16a 1.75f 0.13ab阳性对照组 812.84f 17.54e 274.23f 14.32a 1.57f 0.25a
MDA作为脂质过氧化终产物[31]用于量化脂质过氧化程度，在一定程度上反映组织损伤时出现的过强氧化作用。肝脏组织中MDA含量越高，说明其氧化活性越强，肝脏组织受损越严重[32-33]。模型组与空白对照组相比，MDA含量显著上升26.18%（P＜0.05）（表5）。与模型组相比，酸奶对照组，低、中、高剂量蛹虫草多糖酸奶组，阳性对照组差异显著（P＜0.05）。
SOD、GSH-Px是消除活性氧的重要内源性抗氧化酶[34]。 小鼠在40%乙醇灌胃28 d后，其体内乙醇代谢引发多种氧化应激反应，模型组小鼠肝脏过氧化物的含量显著升高，抗氧化能力明显下降，蛹虫草多糖酸奶组小鼠肝脏抗氧化能力均有所改善。模型组与空白对照组小鼠相比， GSH-Px、SOD活力显著下降（P＜0.05）（表5）。与模型组相比，酸奶对照组，蛹虫草多糖低、中、高剂量酸奶处理组，阳性对照组GSH-Px、SOD活力均有提高。
未添加蛹虫草多糖的对照酸奶对提高肝脏抗氧化的能力有一定作用，与模型组相比，GSH-Px、SOD活力分别提高7.64%、1.90%，MDA含量降低4.90%，高剂量蛹虫草多糖酸奶与模型组相比，GSH-Px、SOD活力分别提高53.95%、25.16%，MDA含量降低49.57%，蛹虫草多糖与植物乳杆菌能够协同提高脂肪代谢能力。蛹虫草高剂量多糖酸奶与联苯双酯对小鼠肝脏抗氧化都有很好的促进作用。
2.7 病理切片分析结果
图 1 肝脏组织病理切片（×400）
Fig. 1 Histological observation of liver tissue (× 400)
由图1可知，空白对照组肝细胞排列规则、形态正常、无脂肪变性症状，肝细胞呈放射状整齐排列，细胞核呈圆形（图1a）；在模型组肝细胞的细胞质中观察到大量的脂肪或水泡变性，并且一些细胞核消失，肝索排列紊乱，肝细胞明显肿胀，甚至出现肝细胞成片坏死 （图1b）；酸奶对照组肝索排列紊乱，并且一些细胞核消失，肝细胞的细胞质中观察到大量的脂肪或水泡变性肝细胞明显肿胀（图1c）；低剂量组中肝细胞肿胀严重，细胞核形状不规则，出现缩固现象（图1d）；中剂量组中央静脉周围仍有部分肝细胞脂肪变性，肿胀范围减小，程度减轻（图1e）；高剂量组中肝细胞结构及肝索排列基本接近正常，未见明显细胞变性及坏死（图1f）；阳性对照组中，肝细胞结构及肝索排列基本接近正常，细胞核形状规则（图1g）。病理组织形态学观察提示：3 种蛹虫草多糖酸奶对小鼠酒精性肝损伤有不同程度的保护作用，其中以高剂量组保护作用比较明显。
3 结 论
不同剂量蛹虫草多糖酸奶组各项指标与阳性对照组各项指标具有相同的变化趋势，肝功能与脂肪代谢功能均得到显著改善，肝脏抗氧化能力显著增强。且高剂量蛹虫草多糖酸奶处理组与等剂量联苯双酯处理相比，大部分指标反映高剂量蛹虫草多糖酸奶对酒精性肝损伤具有同样良好的干预作用。
酸奶对改善肝功能与脂肪代谢功能、增强肝脏抗氧化能力有一定的作用。添加蛹虫草多糖的酸奶对小鼠酒精性肝损伤的保护作用明显高于未添加蛹虫草多糖的酸奶。高剂量蛹虫草多糖酸奶对酒精性肝损伤保护作用效果较好。植物乳杆菌益生发酵的蛹虫草多糖酸奶可发挥蛹虫草多糖和植物乳杆菌在护肝功能方面的协同作用，具有更高的效果，为蛹虫草多糖功能性乳制品的开发推广提供数据支持和理论指导。
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