长时间近冰点温度贮藏对杏果实货架品质的影响

杏树广泛种植于中国北方地区，大多数品种的果实于5～8月成熟[1]。杏果实呼吸强度较高，因而不耐贮藏，采后容易发生软化腐烂、失水、褐变等品质劣变，因此货架期较短。这些因素限制了杏果实的市场供给时间[2]。

近冰点温度（near freezing-point temperature，NFT）贮藏是将果实在接近生物自然结冰点温度下进行长期保存的一项新型贮藏技术[3]。果蔬含有大量的可溶性糖、可溶性酸及可溶性果胶等溶质分子，果肉组织、细胞的结冰点温度显著低于0 ℃。近年来针对鲜切西蓝花[4]、油桃[5]、蓝莓[6]、甜樱桃[7]、磨盘柿[8]等多种果蔬的研究表明，在低于0 ℃、略高于果肉冰点的温度下贮藏果蔬，比以往广泛应用的0 ℃或是高于0 ℃贮藏的保鲜作用效果更佳。相较于传统冰温贮藏，NFT贮藏能更精确地使果蔬在不发生冻害的前提下，保证果蔬更接近结冰点温度贮藏。

尽管很多研究将气调、0 ℃冷藏和保鲜剂处理结合应用，仍很难将杏果实进行长期（大于45 d）贮藏并保持良好的商品品质[1,9]。长时间低温贮藏会使某些品种的果蔬发生冷害，例如褐变、果肉纤维化、产生异味、不能正常后熟等问题[10]。有研究发现，某些品种杏果实在4 ℃下贮藏35 d会出现蔗糖、果糖、葡萄糖、山梨糖醇含量迅速下降等品质劣变问题，并且果肉过氧化氢（H2O2）和丙二醛（malonaldehyde，MDA）的蓄积也随之增加[11]。NFT贮藏可以显著地提高樱桃贮藏后的品质，并高效保持抗氧化功能[7]。

本研究利用新研制的精准控温贮藏设备，系统地研究其对蜜杏贮后品质的影响，并从活性氧代谢、乙烯代谢方面探究了NFT贮藏的影响作用机制，以期为实际生产中应用NFT贮藏鲜技术提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供实验的蜜杏果实采购自北京新发地果蔬批发市场，选取成熟度一致的低熟果实放入塑料筐内，立即运回保鲜实验室进行后续处理。挑选无病虫害，无机械损伤，大小、颜色、外观一致的杏果实进行处理。参照本课题组前期建立的研究方法[1]，选取20 个蜜杏果实进行结冰点和过冷点的测定，确定蜜杏果实的结冰点为（－2.3f 0.1）℃，过冷点为（－2.5f 0.2）℃；因此本实验中的NFT确定为（－2.2f 0.2）℃。

甲醇、乙酸（色谱级）赛默飞世尔科技有限公司；氢氧化钠、碳酸钙、丙酮、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、二硫苏糖醇（分析纯）北京化工厂；H2O2测试盒南京建成生物工程研究所；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

阿贝折光仪上海精密科学仪器有限公司；SC-10精密色差仪苏州欣美和仪器有限公司；GY-2硬度计浙江拓普仪器有限公司；GC-7890F气相色谱仪上海天美生物仪器有限公司；TU-1810APC紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；LC-20AT泵、SPD-M20A二极管阵列检测器和C18反相柱组成的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪日本岛津公司。

NFT贮藏采用本实验室近期发明研制的设备[3]进行，这是一种温控精度高、贮藏室温度均一、具备超温预警机制、可靠性高的用于果蔬近冰温冷藏的专用冷藏设备。其通过以下技术方案实现的：该果蔬NFT贮藏专用冷藏柜具有两套控温措施，通过制冷板和流风机共同调节温度变化，既可以保证贮藏室的温度波动小，又可以减少制冷机的开机频率，保护压缩机。该设计所产生的循环送风模式使贮藏室内部形成了小风力循环气流，保证贮藏室内温度的均一性。报警设备可以进行低温报警，并自动采取紧急措施回避果蔬冻害，可以通过SIM电话呼叫功能通知管理员进行处理。

1.3 方法

1.3.1 实验分组及条件

实验进行2 批次，每批次3 0.0 k g 杏果实（每5.0 kg杏果实分装在一个塑料筐中，每筐果实分别使用自发气调袋套袋），分别在（0f 2）℃和NFT （（－2.2f 0.2）℃）下贮藏70 d。贮藏期间每2 周（14 d）取样一次进行指标测定。两个温度的杏果实贮藏70 d后均置于常温（（22.0f 1.0）℃）进行货架观察。0 ℃样品只进行4 d货架观测，NFT样品可以进行6 d货架观测，间隔2 d取样一次。

1.3.2 乙烯释放速率和呼吸速率的测定

乙烯和呼吸速率的测定参考文献[12]，NFT贮藏和0 ℃贮藏过程中，将6 个杏果实放在常温下（20 ℃）回温1.5 h后放入2 L的密闭容器中2 h，收集1 mL的顶空气体，利用GC-7890F气相色谱仪测定乙烯和CO2浓度。乙烯的释放速率用外标法进行测定，单位为μL/（kgg h）。呼吸速率以每千克杏每小时所累积释放的CO2质量计，单位为mg/（kgg h）。

1.3.3 乙烯代谢相关酶和1-氨基环丙烷-1-羧酸含量的测定

1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶（aminocyclopropane carboxylate synthetase，ACS）和1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶（aminocyclopropane carboxylate oxidase，ACO）酶液提取和活力测定参考Yu Mengmeng等[13]的方法。以所测溶液中乙烯的产生速率表示鲜杏果实ACS的活力，即为nmol/（hg g）；以所测溶液中乙烯的产生速率表示鲜杏果实ACO的活力，即为nmol/（hg g）。1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-amino-1-cyclopropanecarboxylic acid，ACC）含量的测定参照文献[14]，单位为mmol/g，结果以鲜质量计。

1.3.4 糖酸比、色泽、可溶性固形物质量分数和硬度的测定

杏的色泽测定采用SC-10精密色差仪；可溶性固形物质量分数采用阿贝折光仪测定；硬度测定采用 GY-2硬度计。杏果实可滴定酸质量分数的测定采用酸碱中和法[15]。采用HPLC法对可溶性糖组分测定，具体参照文献[11]的方法进行。总糖含量为各单糖含量之和，杏果实的糖酸比按下式[16]计算。

1.3.5 细胞膜透性和丙二醛、H2O2含量的测定

采用电导仪测定电导率，通过电导率表征细胞膜透性。MDA含量的测定参照本课题组前期建立的方法[17]进行。H2O2含量使用H2O2测试盒测定。

1.3.6 抗氧化能力和抗坏血酸、总酚、酚类物质含量的测定

杏果实的总酚提取采用乙醇提取法[1 8]。提取溶液用于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、铁离子清除抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）、总酚含量的测定和酚类物质的分析。

抗坏血酸的含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[18]测定。总酚含量的测定使用福林-酚试剂法[19]。抗氧化能力主要测定DPPH自由基清除能力和FRAP，其测定参考Zhao Handong等[5]的方法，这两种抗氧化活力以奎诺二甲基丙烯酸酯（Trolox）为标准当量，单位g/kg。采用HPLC法对杏的酚类物质含量进行测定，并根据标准品绘制标准曲线进行定量[1]。

1.3.7 活性氧代谢相关的酶活力的测定

过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力的测定参考曹建康等[18]的方法。以每克鲜质量杏果实样品的反应体系在470 nm波长处每分钟吸光度增加1为1 个POD活力单位（U）；以每克鲜质量杏果实样品的反应体系在240 nm波长处每分钟吸光度增加0.01为1 个CAT活力单位（U）。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的测定参照文献[20]，以每分钟每克鲜质量杏果实样品的反应体系在560 nm波长处对氮蓝四唑光化还原的抑制率为50%时为1 个SOD活力单位（U）表示；以每克鲜质量杏果实样品反应体系每分钟OD290 nm变化0.01为1 个APX活力单位（U）。

1.4 数据统计与分析

所有实验都设置3 次平行实验，利用Excel软件对数据进行整理和制图，采用SPSS 18.0软件对测定的数据进行方差分析，利用邓肯氏多重比较对差异显著性进行分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 NFT贮藏对蜜杏呼吸强度和后熟品质变化的影响

在呼吸跃变型果实的后熟过程中，时常伴随着果实的软化、呼吸高峰的出现[1,10,15]及果实色泽的转变[10,19]等现象。其中糖酸比的变化在一定程度上反映了果实的成熟指数[1]。由图1A可知，NFT贮藏延迟了杏果实呼吸高峰的出现，0 ℃贮藏的杏果实呼吸高峰出现在第42天，而NFT贮藏的杏果实呼吸强度在贮藏第56天才达到高峰。贮藏后的杏果实在货架存放时均会出现呼吸强度上升的现象，NFT贮藏货架后4 d的杏果实呼吸强度显著高于0 ℃贮藏货架4 d的杏果实。

由图1B可知，随着贮藏时间延长，杏果实的可溶性固形物质量分数呈先升高后下降的趋势。NFT贮藏末期和货架后的杏果实可溶性固形物质量分数明显高于0 ℃贮藏的杏果实。

由图1C可知，经过70 d的贮藏和6 d的货架后，杏果实硬度都出现明显的下降，但贮藏70 d后，NFT贮藏的果实硬度高于低于0 ℃贮藏的杏果实；在贮后货架存放时，0 ℃贮藏的杏果实硬度没有显著变化（P＞0.05），而NFT贮藏的杏果实硬度从8.61 N下降至4.29 N。这说明长期0 ℃贮藏的蜜杏果实后熟软化出现异常，而NFT贮藏的样品则可以正常软化。

由图1D可知，经过70 d贮藏后，果肉糖酸比均增加，NFT和0 ℃贮藏蜜杏的糖酸比分别达到9.08和9.51。与贮藏70 d相比，经过货架存放后NFT贮藏的杏果实糖酸比显著上升，而0 ℃样贮藏的杏糖酸比无显著变化，这与硬度变化结果相似。表明NFT贮藏对于杏果实贮后和货架食用品质有良好保持作用。

2.2 NFT贮藏对蜜杏外观的影响

果实表皮色泽变化能反映出蜜杏果实的贮后品质变化。从图2A～C可以看出，NFT贮藏果实色泽变化程度明显小于0 ℃贮藏的果实。而货架存放后，NFT贮藏的杏果实转红非常明显，a*值从11.67上升至28.29，显著增加了142.4%。从图2D中可以看出，NFT贮藏后果实外观正常，果皮和果肉都转为橙红色；而0 ℃贮藏的杏果实表皮和果肉呈现黄色，果肉有褐变、果皮凹陷，表明发生一定程度的冷害。综合上述杏果实贮后品质的结果可以发现，NFT贮藏比0 ℃贮藏能更好地保持杏果实贮藏后品质保持作用，且能延长杏果实贮藏后的货架期，并使杏果实正常完成后熟。

2.3 NFT贮藏对蜜杏果实乙烯代谢的影响

杏是一种典型的呼吸跃变型果实[21]，而乙烯是呼吸跃变型果实成熟的一种必要内源生物激素[22]。由图3A可知，蜜杏果实在贮藏过程中乙烯释放速率很低，最高峰值也只有0.29 μL/（kgg h）；但在贮藏后的货架存放期间，NFT贮藏的杏乙烯释放量峰值达到了 3.97 μL/（kg h），是0 ℃贮藏杏果货架期间乙烯释放峰值的2.7 倍，这可能与杏贮藏后熟品质变化有直接关系。蜜杏在0 ℃贮藏70 d后后熟出现异常，可能是其内源乙烯合成能力下降造成的。在香蕉[23]、李[24]、番木瓜[25]果实的研究中也有相似的结论，由于低温胁迫造成乙烯代谢紊乱，从而出现后熟异常等冷害问题。

ACC是果实乙烯合成前体物质，ACS是合成ACC的关键酶，ACO是催化ACC生成乙烯的关键酶。由图3B～D可知，贮藏过程中杏果实ACC含量和ACS、ACO活力均处于很低的水平；贮藏后的货架观测期间，NFT杏果实的ACC含量、ACS和ACO活力均明显上升，但0 ℃贮藏果实货架期间的ACC含量、ACS和ACO活力变化没有NFT贮藏果实货架期果实明显，这与乙烯释放情况一致。类似结果在番茄[22]和鳄梨[26]、粉蕉[27]果实乙烯代谢的研究中也有报道。

由上述研究结果可以推断，0 ℃低温长时间贮藏破坏了蜜杏果实ACS的合成能力，影响了杏果实后熟过程中ACC的合成，同时也抑制了ACO活力提高，因而导致0 ℃贮藏杏果实贮后乙烯合成比NFT贮藏的杏果实更少，进而导致0 ℃贮后杏果实后熟情况比NFT果实更差。

2.4 NFT贮藏对贮后蜜杏活性氧指标变化的影响

NFT贮藏杏果实在贮后货架期表现出比0 ℃更好的乙烯代谢和后熟品质很可能是因为在贮藏过程中的活性氧代谢体系更稳定，而活性氧代谢是维护果蔬体内正常代谢的基础[7,19,28]。细胞膜透性增强是组织细胞衰老变化的一个标志性变化，H2O2是植物体内细胞活性氧代谢作用的副产物，具有强氧化性，能够导致生物大分子的氧化损伤和膜的氧化损伤。由图4A可知，杏果实果肉细胞膜透性随着贮藏时间延长而不断上升，特别是在贮藏后的货架期间，0 ℃贮藏的杏果实组织膜透性急剧增大，明显高于NFT贮藏的杏果实组织。由图4B、C可知，NFT和0 ℃贮藏杏果实肉中MDA和H2O2含量在贮藏期间均呈现缓慢上升趋势，但在贮藏末期，0 ℃贮藏杏果实肉中的H2O2水平明显高于NFT贮藏的杏果实；而货架观测期间，0 ℃贮藏杏果实肉MDA和H2O2含量急速上升，0 ℃货架第4天MDA和H2O2含量分别是NFT货架第6天杏样品的1.3 倍和1.6 倍。这说明NFT贮藏可以更有效地抑制活性氧代谢中MDA和H2O2的积累，减少细胞膜被破坏程度。

2.5 NFT贮藏对贮后蜜杏抗氧化活性的影响

由图5可知，随着贮藏时间的延长，蜜杏果实的DPPH自由基清除能力和FRAP不断下降。贮藏70 d后，NFT贮藏杏果实的DPPH自由基清除能力和FRAP分别下降了10.4%和11.1%；在0 ℃的杏果实DPPH自由基清除能力和FRAP分别下降了31.3%和15.9%。在货架存放期间，杏果实抗氧化能力进一步下降，最终NFT组杏果实贮后6 d货架的抗氧化能力明显高于0 ℃贮后4 d货架的杏果实（P＜0.05）。本研究中的结果与NFT贮藏通过提高抗氧化能力来保护樱桃活性氧代谢稳定的研究结果[7]一致。

2.6 NFT对贮后蜜杏抗坏血酸和酚类物质含量的影响

杏果实的抗氧化能力主要源于多酚物质和抗坏血酸的作用，芦丁和绿原酸是杏果实多酚的主要成分[1]。如图6所示，杏果实中总酚、抗坏血酸、芦丁和绿原酸含量随贮藏时间延长呈现不断下降趋势。相对于0 ℃贮藏，NFT贮藏明显抑制了杏果实总酚、抗坏血酸、芦丁和绿原酸含量下降。货架期间，NFT贮藏组杏果实的4 种抗氧化活性物质成分含量显著高于0 ℃贮藏的杏果实（P＜0.05）。表明NFT贮藏可以有效地保留抗氧化活性物质，保持果实在贮藏过程中的抗氧化能力。

2.7 NFT贮藏对贮后蜜杏活性氧代谢酶活力的影响

在果蔬生物活性氧清除系统中，SOD是歧化超氧阴离子形成H2O2的关键酶，POD、CAT、APX是清除过量H2O2的相关酶，因此保持这一系列酶活性对于保护果蔬活性氧代谢和长时间贮藏有重要的意义[29]。如图7A、B所示，贮藏过程中，蜜杏的SOD和CAT活力呈现先增加后下降的趋势；在贮藏70 d后，NFT贮藏杏果实SOD和CAT活力显著高于0 ℃贮藏的杏果实。贮藏后货架存放期间，NFT杏样品的SOD活力急剧增加。NFT和0 ℃贮藏的杏果实CAT活力在货架期都出现一个高峰，但NFT贮藏杏果实的CAT活力峰值比0 ℃贮藏杏果实CAT活力峰值高21.3%。蜜杏的APX活力在贮藏过程中持续下降，但在贮藏后期NFT贮藏杏果实的APX活力显著高于0 ℃贮藏杏果实（图7C）。在贮藏过程和贮后货架中，NFT样品和0 ℃样品的POD活力差异不明显（图7D），这说明在蜜杏中POD活力可能和活性氧清除能力的关系不大。而SOD、CAT和APX是蜜杏在长时间低温贮藏中清除活性氧的关键酶，并且在长时间低温贮藏后，0 ℃贮藏的蜜杏上述酶活力开始降低，从而导致MDA和H2O2的积累，并最终对杏果实的其他代谢造成不可逆的影响。

3 讨论

在本实验中，蜜杏果实在经过长时间低温贮藏后，产生了H2O2等大量活性氧物质。这是由于植物在面对不同的环境胁迫时，会迅速产生大量的活性氧（包括羟自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢等）来进行自我防御[28]。当产生过量的活性氧时，植物自身抗氧化系统有效地发挥作用，包括非酶体系抗氧化物质（多酚、抗坏血酸等）及酶系统的抗氧化酶（SOD、CAT、APX、POD、谷胱甘肽还原酶等）[29]。由于NFT贮藏可以有效地保持杏果实在贮藏70 d后SOD、CAT和APX活力和抗坏血酸、多酚等生物活性物质含量，因此可以维持货架后杏果实的活性氧代谢的稳定性，从而保证杏果实货架过程中的品质。而0 ℃贮藏由于活性氧代谢系统失衡（酶活力、抗氧化活性物质含量和抗氧化能力降低），与NFT贮藏组相比，则出现货架后乙烯合成前体和乙烯释放量降低、ACS和ACO活力下降的现象，从而使0 ℃贮藏的蜜杏果实出现不能达到正常成熟的品质状态的现象。这可能是因为，在正常状态下，植物活性氧的产生与清除处于动态平衡的状态，活性氧浓度很低时不会对机体造成伤害，但是如果果蔬在遭遇逆境胁迫，机体内的氧代谢失调导致活性氧累积，而细胞内活性氧清除系统不能及时有效地清除过量的活性氧，较高浓度的活性氧会对植物体的其他正常生理代谢造成严重的伤害[19,29]。

4 结论

本研究结果表明，0 ℃下冷藏的蜜杏在常温货架过程中会出现不能正常成熟软化等贮后生理紊乱现象，而NFT贮藏的杏果实在常温货架放置后能够达到正常成熟的品质状态。贮藏和货架过程中，NFT贮藏后的杏果实乙烯释放量、ACC含量和ACS、ACO活力均高于0 ℃贮藏后的杏果实样品。在经过70 d的贮藏后，NFT能够比0 ℃贮藏更好地维持杏果实SOD、APX、CAT活力。并且与0 ℃贮藏杏果实相比，NFT贮藏组杏果实的抗坏血酸含量、总酚含量和DPPH自由基清除能力更高，MDA和H2O2的积累更少。因此，NFT贮藏不仅可以有效延长杏果实的贮藏期，还可以维持蜜杏正常的生理代谢进程，保持杏果实在冷藏后仍具有较好的货架品质。NFT贮藏技术作为一种安全简便、效果明显的保鲜技术，可以更广泛地推广至其他具有冷耐受性的果蔬产品。

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