酱卤肉制品具有营养丰富、风味浓郁的特点，深受广大消费者的喜爱；但是酱卤肉制品易受微生物生长繁殖而腐败变质，导致其货架期极短。目前，酱卤肉制品保鲜技术有保鲜剂保鲜、低温保藏、杀菌与包装等[1]。保鲜剂在食品工业化中应用较为普遍，但随着食品安全问题的频发，化学类保鲜剂的安全性日益受到消费者的质疑，天然保鲜剂逐渐受到人们的关注与青睐[2]。
可食用膜在肉制品保鲜领域中有着独特的优势，它可以改变表面微气调的环境，有效阻止汁液流失和隔绝外界微生物，从而达到防腐保鲜的目的[3]。海藻酸钠具有良好的生物相容性和可降解性，且价格低廉、成膜性好，已被国家标准允许添加在酱卤肉制品中，较适合作为肉制品的可食用膜材料[4]。然而，单一的海藻酸钠涂膜保鲜效果不理想。大量研究表明，添加精油在海藻酸钠可食用膜中可显著改善其抗菌性、抗氧化性及膜脆性[5-7]。
植物精油作为一种天然的食品添加剂与香料，已被证明具备良好的抗氧化性及抗菌功能[8]，作为天然保鲜剂在食品保鲜领域已有广泛的应用[9]。Maizura等[7]研究表明在海藻酸钠可食用膜中添加柠檬精油可显著改善其抗菌及机械性质。然而，精油水溶性差、易挥发、香气强烈等特点使其在食品中的应用受到极大限制[10]。为了保留精油抗菌活性的同时降低其对食品感官品质的影响，制备一种负载精油的运载体系十分必要[11]。其中，纳米乳液作为包封疏水性成分的有效载体，可提高疏水性物质的溶解度、稳定性及生物活性[12]，且可使对食品的感官刺激最小化[10]。此外，海藻酸钠还可改善乳液的理化性质[13]。基于精油纳米乳液可食用膜对鲜切果蔬及生肉制品的保鲜研究较多[14-16]，而对于熟肉制品的研究鲜有报道。因此本研究以海藻酸钠为成膜剂，分别采用高速剪切与微射流高压均质制备柠檬精油粗乳液与纳米乳液可食用涂膜液。对两种乳液涂膜液的理化性质进行表征，并研究精油乳液可食用涂膜液对冷藏卤鸭脖菌落总数、pH值、汁液损失率、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值、色差等指标的影响，以期延长卤鸭脖的货架期及扩大精油在熟肉制品中的应用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
气调锁鲜盒卤鸭脖产品取自煌上煌集团有限公司（该产品经原料鸭脖、盐腌、卤制、摊凉、切割、气调包装等环节完成产品的制作过程，包装盒内充N2），成品包装贮藏12 h后用于实验。
柠檬精油（水蒸气蒸馏法提取，纯度大于99%） 粤渝精油商城；海藻酸钠和吐温-80 西格玛奥德里奇（上海）有限公司；三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、氧化镁等 国药集团（北京）有限公司；平板计数琼脂 青岛海博生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
CR-400色差计 日本柯尼卡-美能达公司；T6紫外-可 见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；T25高速分散均质机 德国IKA公司；SV-10黏度计 日本东京A&D公司；M-110动态高压微射流 美国Microfluidic 公司；Nanoseries ZS激光粒度仪 英国Malvern公司。
1.3 方法
1.3.1 精油乳液-海藻酸钠可食用涂膜液的制备
将2 g海藻酸钠粉末缓慢加入至95.5 mL无菌水中，70 ℃水浴加热并磁力搅拌3 h至溶液呈均一状态，冷却至室温后分别加入2 mL柠檬精油、1.5 mL吐温-80、1 mL甘油，以14 000 r/min均质2 min，得到含海藻酸钠2 g/100 mL的粗乳液涂膜液。随即将制得的粗乳液于120 MPa压力下经微射流处理3 次，即得到纳米乳液涂膜液，置于4 ℃冰箱备用。
1.3.2 粗乳液与纳米乳液涂膜液的粒径与ζ-电位测定
采用激光纳米粒度仪测定乳液的平均粒径及ζ-电位，参数设置为颗粒折射率1.453；颗粒吸收率0.001；分散剂折射率1.330，采用体积平均粒径（d4,3）表征液滴粒度的大小。
1.3.3 粗乳液与纳米乳液涂膜液的黏度与白度指数测定
在室温条件下，采用振动式黏度计于30 Hz恒定振幅测定粗乳液与纳米乳液涂膜液的黏度。
采用色差计对涂膜液的L*、a*、b*值进行测定，自检后使用白板进行校准，每个样品随机测定5 点。白度指数按公式（1）[17]计算。
1.3.4 负载精油乳液的可食用涂膜液对卤鸭脖的涂膜保鲜实验
1.3.4.1 原料处理
从冷库中取出当日生产的气调包装卤鸭脖，在无菌操作台中取样分别浸没上述涂膜液10 s，置于筛网沥水沥干，转入聚乙烯袋真空包装；实验对照为海藻酸钠溶液，空白对照为不做任何处理。所有样品置于4 ℃冰箱中进行贮藏，分别于贮藏第1、4、6、8、12天测定各项指标。
1.3.4.2 pH值的测定
准确称取5.0 g肉样，加入50 mL蒸馏水，剪碎后6 000 r/min分散30 s，然后匀浆，用pH计在室温下直接测定pH值。
1.3.4.3 汁液损失率的测定
参照Gharibzahedi等[16]的方法，称取样品、包装袋与残留在包装内渗出肉汁的总质量（m1/g），剪开包装袋，缓慢取出袋内的鸭脖放入盘中，称取包装袋和肉汁质量（m2/g），预先称量包装袋质量（m3/g）。汁液损失率按公式（2）计算。
1.3.4.4 TBARS值的测定
TBARS值的测定参照彭泽宇等[18]的方法。称取10 g绞碎均匀的肉样，加入50 mL 7.5 g/100 mL三氯乙酸（含0.1 g/100 mL乙二胺四乙酸），摇荡30 min后过滤。取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液并沸水浴加热40 min，取出冷却后离心（4 000 r/min，20 min）。取上清液并加入5 mL氯仿，摇匀静置分层，取上清液在532 nm处测定吸光度。TBARS值按公式（3）计算。
式中：m表示样品质量/g。
1.3.4.5 TVB-N含量的测定
TVB-N含量参照GB 5009.228ü 2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的自动凯氏定氮法测定。
1.3.4.6 菌落总数的测定
菌落总数参照GB 4789.2ü 2016《食品安全国家标准 食品微生物菌落总数测定》的方法测定。
1.3.4.7 色差的测定
色差测定参照Noori等[19]的方法。使用色差计对鸭脖表面的L*、a*、b*值进行测定，自检后使用白板进行标准校正，每个样品随机测定5 点。色差ΔE按公式（4）计算。
式中：其中
为样品初始色泽；
为贮藏t/d时的色泽。
1.4 数据统计与分析
所有实验重复3 次，使用SPSS 22.0软件进行数据统计分析，差异显著性采用单因素方差分析，实验结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 2017软件作图。
2 结果与分析
2.1 粗乳液及纳米乳液涂膜液的性质
柠檬精油乳液涂膜液的粒径对涂膜后的渗透性、色泽或保鲜效果等指标有着重要的影响[20]。两种乳液的粒径分布如图1所示，精油粗乳液经高速剪切后得到，粒径为196.2 nm。而经过微射流处理得到的纳米乳液，分布系数（polydispersity index，PDI）降低，粒径显著减小到41.53 nm。在微射流处理过程中，精油油滴经撞击和空穴效应后高度破碎[21]。而粒径越小，重力的分散效果越好，有利于减少絮凝，从而提高乳液的稳定性。
图 1 柠檬精油粗乳液与纳米乳液的粒径分布图
Fig. 1 Droplet size distribution of lemon essential oil-loaded emulsion and nanoemulsion
柠檬精油粗乳液与纳米乳液涂膜液的电位见表1。通常乳液的电位由吸附在油滴周围的表面活性剂所决定，非离子型表面活性剂（吐温-80）稳定的乳液理论上电位应接近于0[20]，然而实际结果却为负，表明离子型生物聚合物（海藻酸钠）的掺入影响了乳液的电位。大量研究表明，乳液的负电荷可能与连续相中阴离子海藻酸钠的吸附有关[22-23]。油滴之间通过静电排斥作用可提高乳液的稳定性，而通过微射流制备的柠檬精油纳米乳液的净电荷（电位的绝对值）显著高于粗乳液（P＜0.05），与前人报道的结果[17]一致，可能是由于微射流过程中的机械应力使海藻酸钠分解，进一步增加了吸附在油-水界面上分子的数量。
表 1 负载柠檬精油的粗乳液与纳米乳液涂膜液的理化性质
Table 1 Physicochemical characterization of emulsion and nanoemulsion coatings loaded with lemon essential oil
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
精油种类 粒径/nm 电位/mV 黏度/（mPag s） 白度指数柠檬精油粗乳液 196.8f 1.3a －8.3f 0.4b 251.7f 10a 57.64f 0.24a柠檬精油纳米乳液 41.4f 0.2b －25.3f 4.5a 157.3f 9.1b 25.34f 0.05b
柠檬精油粗乳液的白度指数显著高于纳米乳液 （P＜0.05）。从外观上观察，柠檬精油纳米乳液呈现半透明，而粗乳液则为乳白色（图1）。乳液的外观主要由粒径、浓度和折射率等参数所决定[24]，纳米乳液由于小液滴非常弱的光散射而呈现半透明。随着粒径的增加，光散射逐渐增强，外观趋于不透明。为了不改变食物自身的色泽，透明的成膜溶液更适用于食品应用。此外，两种精油乳液的黏度显著低于纯海藻酸钠溶液（500 mPag s），可能是由于微射流的高剪切力诱导聚合物链的构象变化或降解，进而引起分子质量的改变[25]。
2.2 负载精油乳液的可食用涂膜液对鸭脖的涂膜保鲜效果
2.2.1 涂膜保鲜鸭脖贮藏期间pH值的变化
图 2 不同涂膜处理的鸭脖在贮藏期间的pH值变化
Fig. 2 Changes in pH of pot-stewed duck necks treated with different coatings during storage
相同贮藏时间不同组别小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
肉制品贮藏期间pH值的变化主要由微生物降解糖原产生的乳酸等有机酸和降解蛋白质产生的胺类等碱性物质引起[26]。如图2所示，新鲜的卤鸭脖偏弱酸性，实验组与空白组pH值均呈现出先降后升的趋势，这与Hu Jing等[27] 报道的4 ℃贮藏下冷鲜肉pH值变化规律一致。在贮藏1～4 d时，由于乳酸菌等微生物代谢糖类产酸，使所有组pH值明显下降。随后空白组在第4天时pH值开始上升，可能是微生物利用完糖类物质后开始降解蛋白质并产生碱性的胺及氨类，腐败程度逐渐加剧[28]。而精油纳米乳液组和海藻酸钠组的拐点发生在第8天，这一延迟的现象可能是由于涂膜抑制了好氧菌的生长，从而减缓了蛋白质的分解速度[5]。而粗乳液在第4天pH值即开始上升，可能与粗乳液在第4天时pH值最低、蛋白质降解程度大使pH值波动较大有关。此外，第8天后精油涂膜组的pH值增幅均低于海藻酸钠组，说明精油中的酚类与萜类等物质发挥出的抗菌作用抑制了腐败微生物的代谢。贮藏末期3 个实验组pH值从小到大依次为：粗乳液＜纳米乳 液＜海藻酸钠，这可能与3 种涂膜液的抑菌效果有关，细菌被抑制会影响细菌在贮藏后期代谢分解蛋白质产生碱性物质的量，因此对贮藏前期代谢积累的酸性物质中和作用有强有弱，可能使最终的实验组pH值不同[29]。
2.2.2 涂膜保鲜的鸭脖贮藏期间汁液损失率的变化
图 3 不同涂膜处理的鸭脖在贮藏期间的汁液损失率的变化
Fig. 3 Changes in juice loss of pot-stewed duck necks treated with different coatings during storage
汁液流失主要是因为蛋白质胶体无法维持凝胶结构中的水分而导致汁液渗透出组织之外。若汁液流失严重，即肉制品持水能力下降，肉质口感僵硬，将影响产品感官品质。如图3所示，由于冷藏引起水分汽化以及微生物代谢活动[30]，各组的汁液损失率均呈显著上升趋势。其中空白组的增速最快，在第12天时，海藻酸钠与空白组汁液损失率分别达到了9.5%和10.1%。而精油乳液涂膜组的汁液损失率均显著低于空白组（P＜0.05），是因为一方面海藻酸钠可食用膜覆盖于鸭脖表面有利于减少汁液损失；另一方面，膜内的精油增强了膜的疏水性与抑菌性，也能减少汁液的流失[31]。纳米乳液实验组相比精油粗乳液具备更低的汁液损失率，这可能是因为粒径越小越有助于均匀分布在肉制品表面，使得乳液中的精油挥发较少[32]。据报道多糖可与肉中蛋白质产生相互作用增强持水性，减少肉制品的汁液流失[16]。因此应用精油乳液可食用膜可有效降低汁液损失率，减少风味变化，且柠檬精油纳米乳液涂膜组的汁液损失率最低，维持产品汁液的效果最好。
2.2.3 涂膜保鲜的鸭脖贮藏期间TBARS值的变化
卤鸭脖在贮藏过程中脂肪氧化会导致风味改变，或是产生一些有毒物质影响产品的品质，而TBARS值被广泛应用在肉制品中的脂类二级氧化评价[33]，其能反映脂肪的二级氧化分解产物含量。如图4所示，不同涂膜的实验组TBARS值在贮藏期间呈增长趋势。空白组TBARS的起始值仅为1.19 mg/kg，贮藏期间，精油乳液组上升的趋势较海藻酸钠与空白组而言更为平缓，但纳米乳液组与粗乳液组无显著性差异（P＞0.05）。一方面，海藻酸钠涂膜较好地屏蔽了氧气渗透[34]；另一方面，精油乳化后提高了抗氧化作用[9]。精油的抗氧化活性归因于各种机制，包括阻止自由基链引发、螯合金属离子、分解过氧化物、与自由基反应[33]。在贮藏末期8～12 d时，实验组与对照组均明显上升。第12天空白组的TBARS值显著高于精油乳液组，高达3.23 mg/kg；纳米乳液组与粗乳液组分别为2.80 mg/kg与2.77 mg/kg，无显著性差异 （P＞0.05）。本实验贮藏期间没有出现TBARS值趋于稳定的现象，可能是相较生肉产品而言贮藏时间过短 所致[35]。综上，精油乳液作为天然抗氧化剂负载进可食用膜中，可以通过抗氧化性涂膜延长产品的货架期。
图 4 不同涂膜处理的鸭脖在贮藏期间的TBARS值的变化
Fig. 4 Change in TBARS value of pot-stewed duck necks treated with different coatings during storage
2.2.4 涂膜保鲜的鸭脖贮藏期间TVB-N含量的变化
图 5 不同涂膜处理的鸭脖在贮藏期间的TVB-N含量的变化
Fig. 5 Change in TVB-N content of pot-stewed duck necks treated with different coatings during storage
TVB-N是指动物性食品中蛋白质因酶、微生物的作用而降解产生的碱性含氮物质[36]。鸭脖贮藏期间TVB-N含量变化如图5所示，各组TVB-N含量随着贮藏时间的延长均呈现上升趋势，且精油乳液组均显著低于对照组 （P＜0.05）。空白组的TVB-N含量在第8天时已达到24.73 mg/100 g，而精油乳液处理组第8天时均低于18 mg/100 g。此后，所有样品由于贮藏后期微生物大量繁殖加快了对蛋白质的分解，致使TVB-N含量上升速度加快，与贮藏后期pH值逐渐上升结论一致。贮藏末期的第12天，空白组鸭脖的TVB-N含量已高达33.6 mg/100 g，而柠檬精油纳米乳液组抑制效果最好，仅为20.76 mg/100 g，说明柠檬精油纳米乳液能有效减缓鸭脖的腐败速度。此外，海藻酸钠组的增长速率低于空白组，可能是由于海藻酸钠涂膜液在肉表面形成的膜均匀致密，具有很好的阻氧阻湿作用，一定程度上能抑制细菌生长，减缓蛋白质的分解速度[5]。综上，精油粗乳液与纳米乳液可食用膜均能有效减缓TVB-N含量的上升，且纳米乳液可食用膜抑制TVB-N含量上升的效果最佳。
2.2.5 涂膜保鲜的鸭脖贮藏过程中菌落总数的变化
如图6 所示， 空白组第1 天的菌落总数为 2.57（lg（CFU/g）），而纳米乳液与粗乳液组分别为1.27（lg（CFU/g））与2.16（lg（CFU/g）），表明可食用膜中的精油乳液对鸭脖中的微生物有明显的抑制作用[37]。随着贮藏时间延长，所有组的菌落总数均明显上升，且空白组显著高于其他3 组（P＜0.05）。 在第8天时，空白样品达到4.91（lg（CFU/g）），超过G B 2 7 2 6 ü 2 0 1 6《食品安全国家标准 熟肉制品》（菌落总数≤8 0 0 0 0 C F U/g，即不超过 4.903（lg（CFU/g））），此时其他组均未超标。空白样品的保质期为8 d，符合商品标识。第12天时空白组菌落总数上升至5.79（lg（CFU/g）），柠檬精油纳米乳液、粗乳液与海藻酸钠涂膜组则分别为4.85、5.26、 5.58（lg（CFU/g）），精油纳米乳液涂膜组仍未超标。精油的抑菌效果得益于有效成分可以进入微生物细胞壁、细胞膜以及线粒体，干扰酶促反应、破坏细胞膜结构[38]；且能抑制微生物分解蛋白质形成含氮物质[39]。相较纯精油而言，乳液更易渗透接触细菌，且粒径越小抑菌效果 越好[40]，并且精油纳米乳液抑菌性的提高可能与较高的负电荷影响细菌细胞膜有关[32]。因此，使用精油乳液可食用膜进行涂膜的鸭脖菌落总数显著低于海藻酸钠组与空白组，且纳米乳液可食用膜的效果最佳。此外，据报道纳米乳液还可实现精油的缓释效果，使其在产品表面长时间稳定释放[41]。以上结果表明海藻酸钠涂膜只能在一定程度上抑制鸭脖菌群的生长，而负载精油的乳液能更有效抑制微生物的生长繁殖，且精油纳米乳液可食用膜的抑菌效果最佳，使货架期从8 d显著延长至12 d。
图 6 不同涂膜处理的鸭脖在贮藏期间的菌落总数的变化
Fig. 6 Changes in total bacterial count of pot-stewed duck necks treated with different coatings during storage
2.2.6 涂膜保鲜的鸭脖贮藏过程中色泽的变化
对于消费者而言，色泽是指示产品新鲜程度和整体质量最直观的一个质量参数[19]，消费者在非接触状态下倾向于通过视觉评价肉制品的质量。涂膜保鲜鸭脖色差值（ΔE）的变化见表2，ΔE越大，表明与原始色泽相比变化越大。贮藏时间对色差值具有一定的影响，除海藻酸钠组外，其他组样品ΔE随贮藏时间延长而增大，这可能与贮藏过程中发生的腐败变质有关。纳米乳液涂膜的ΔE和粗乳液涂膜组无显著性差异（P＞0.05），但纳米乳液稍低于粗乳液组，这可能是由于纳米乳液的粒径更小，使精油分散更均匀，且透光率增加，使涂膜后鸭脖表面色泽变化不明显。结合菌落总数结论可知，空白对照组虽然在第8天菌落总数已超标，但色泽并无显著性变化（P＞0.05），故消费者难以通过视觉判断产品货架期。此外，在贮藏第12天时，柠檬精油纳米乳液与海藻酸钠涂膜组的ΔE比对照组要稍低，但无显著性差异 （P＞0.05）。据报道，对视觉感官无损的技术更有前景在食品中应用[19]。柠檬精油纳米乳液组与空白组ΔE差异不大，因此柠檬精油乳液可食用膜的使用对于鸭脖在贮藏期间的外观无明显影响，利于工业化应用。
表 2 不同涂膜处理的鸭脖在贮藏期间的ΔE变化
Table 2 Changes in color difference of pot-stewed duck necks treated with different coatings during storage
注：同行肩标大写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
实验组 贮藏时间/d 1 4 6 8 12柠檬精油粗乳液 0.86f 0.49bC 1.70f 0.37abBC 1.93f 0.07bB 2.07f 0.33aAB 3.05f 0.50aA柠檬精油纳米乳液 2.09f 0.64abAB 1.06f 0.28bC 1.25f 0.11cBC 1.36f 0.28abABC 2.27f 0.11abA海藻酸钠 3.21f 0.75aA 2.52f 0.71aAB 2.33f 0.12aAB 1.48f 0.64abB 1.74f 0.29bAB空白组 1.17f 0.42bB 0.62f 0.56bB 1.05f 0.09cB 1.05f 0.08cB 2.66f 0.68abA
3 结 论
微射流对柠檬精油乳液粒径有显著的影响，而海藻酸钠能够影响精油乳液的电位与黏度。外观上粗乳液呈现乳白色，而纳米乳液呈现半透明，且柠檬精油纳米乳液的白度指数与黏度最低。空白组鸭脖的品质随着贮藏的时间延长而下降，菌落总数、TVB-N含量和TBARS值逐渐上升，汁液流失严重，第12天时已完全腐败，而柠檬精油纳米乳液的保鲜效果最好。国家标准中对菌落总数要求严格，柠檬精油粗乳液可有效抑制卤鸭脖菌落数的增长，纳米化则进一步提高了柠檬精油乳液组的抑菌效果，第12天时空白样品菌落总数上升至 5.79（lg（CFU/g）），柠檬精油纳米乳液、粗乳液与海藻酸钠涂膜组则分别为4.85、5.26、5.58（lg（CFU/g））， 精油纳米乳液涂膜组仍未超标。此外，柠檬精油乳液组与空白组色差无明显差异。综上所述，柠檬精油复合海藻酸钠可食用膜可显著提高卤鸭脖保鲜效果，且精油纳米乳液涂膜的保鲜效果要优于粗乳液涂膜效果，将产品的货架期由8 d延长至12 d。
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