茶树花花芽从6月份开始分化，延续到11月，花期较长，盛花期集中在10月中旬到11月中旬，占年开花时间的85%以上。茶树花内含物质丰富，具有多种对人体有益的生理活性物质，卫生部在2013年第1号公告中批准茶树花为新资源食品，允许生产经营。茶树花的化学组成与茶叶基本相同，对人体有延缓衰老[1]、预防癌症[2]等功效，茶树花可加工成茶树花酒[3]、茶树花护肤品[4]、食品添加剂[5]，也可以干燥成茶树花茶直接冲泡饮用。鉴于茶树花具有广阔的应用前景，本实验研究加工工艺对茶树花茶中功能性成分含量、抗氧化活性、感官风味的影响。
目前茶树花茶的加工工艺主要有热风烘干[6]、微波红外结合热辐射干燥[7]、微波干燥[8]、真空冷冻干燥[9]等方式，相关研究侧重于分析干燥工艺对茶树花的常规成分（水浸出物、游离氨基酸总量、茶多酚总量、茶皂素、抗氧化活性）的影响，鲜有探讨加工方式对茶树花中儿茶素组分、茶没食子素、可可碱、茶叶碱的影响。黄燕芬等[10]认为以微波杀青结合恒温箱烘干法制作的茶树花茶外观和感官品质均是最好的；王振康等[11]比较微波杀青和热力杀青对茶树花中水浸出物、茶多酚和游离氨基酸含量的影响，认为微波杀青能保存茶多酚和氨基酸的含量；聂樟清等[12]认为杀青方式对茶树花水溶性糖、水浸出物和感官品质影响较大，而干燥方式对生化成分影响不大；Chen Zhenchun等[13]利用超临界二氧化碳萃取法提取的茶树花精油表现出良好的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除能力；屠幼英[14]利用高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）技术从茶树花乙酸乙酯层中鉴定出了8 种儿茶素，并证明其在茶树花抗氧化活性中起主要作用。因此，本研究采用HPLC-MS技术分析炒青烘干、微波烘干、真空冷冻干燥处理下茶树花茶常规成分、儿茶素组分、生物碱组分、酚酸组分等功能性成分的变化，比较不同工艺处理下茶树花茶对DPPH清除能力的影响，探讨成品的感官风味特征与形成原因，总结出茶树花中的生物碱（咖啡碱、可可碱、茶叶碱）、酚酸（茶没食子素、没食子酸）的变化规律，以期为开发利用茶树花资源提供有效的功能性成分数据，为茶树花加工提供具体工艺参数，为不同风味茶树花茶产品正式投产提供理论依据与数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
以2017年10月于福建农林大学安溪茶学院科教茶园（安溪县参内乡）采摘的‘黄金桂’茶树品种的半开放花苞为原料，匀堆并分成三等份。
碱式乙酸铅、盐酸、浓硫酸、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、茚三酮、福林-酚试剂、DPPH国药集团化学试剂有限公司；没食子酸标准品、咖啡碱标准品、可可碱标准品、茶氨酸标准品等 美国Sigma公司；甲醇、乙腈（均为色谱级） 德国默克公司。
1.2 仪器与设备
微波炉 广东格兰仕公司；6CDG型锅炒杀青机福建佳友茶叶机械公司；DHG-9240A型电热鼓风干燥箱 厦门精艺兴业科技有限公司；ALPHA1-2 LD plus型真空冷冻干燥机 德国Christ公司；WK-400B型茶叶粉碎机、BSA124S型分析天平、HWS-24型电热恒温水浴锅 厦门精艺兴业科技公司；超低温冰箱 青岛海尔公司；分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；UV-1750型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；e2695高效液相色谱仪（配有2998PDA检测器及Enpower2分析软件） 美国Waters公司；色谱柱Phenyl-Hexyl 100Å（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美国Phenomenex公司；1100高效液相色谱（配有二元泵加图像二极管阵列检测器） 美国Agilent公司；电喷雾HCT Ultra PTM Discovery System离子阱质谱（配有ESI Compass 1.3软件）美国Bruker Daltonics公司。
1.3 方法
1.3.1 茶树花前处理及加工工艺
将采摘的茶树鲜花均匀平摊于水筛上，日光萎凋1 h后，按照1.3.1.1～1.3.1.3节的步骤分别制作锅式杀青烘干（简称炒青烘干）、微波杀青烘干（简称微波烘干），真空冷冻干燥工艺的茶树花茶。每个实验重复3 次。
1.3.1.1 锅式杀青烘干
杀青锅预热至220 ℃左右，投入600 g左右的茶树花，高温杀青5 min后，摊凉15 min，放入预热至110 ℃烘箱烘干至水分质量分数为3%左右。
1.3.1.2 微波杀青烘干
微波炉设置高火档，茶树花平铺1 cm厚度，运行50 s，翻拌，再运行50 s，摊凉15 min，放入预热至110 ℃烘箱烘干至水分质量分数为3%左右。
1.3.1.3 真空冷冻干燥
新鲜采摘的茶树花直接放入超低温冰箱-20 ℃预冻结5 h，放入真空冷冻干燥机托盘中干燥，处理真空度0.001 2 mbar、温度-50 ℃、运行时间20 h。
1.3.2 生化成分与自由基清除能力测定
1.3.2.1 常规生化成分含量测定
试样的制备及干物质含量测定参照GB/T 8303—2013《茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定》[15]；水浸出物含量测定参照GB/T 8305—2013《茶 水浸出物测定》[16]；茶多酚总量测定参照ISO 14502-1[17]；游离氨基酸总量检测参照GB/T 8314—2013《茶 游离氨基酸总量的测定》[18]。
1.3.2.2 儿茶素、酚酸、生物碱含量测定
参考ISO 14502-2[19]中的色谱法分离儿茶素、酚酸、生物碱，采用内标法定量分析没食子酸、咖啡碱、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、(＋)-儿茶素（(＋)-catechin，(＋)-C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、表儿茶素没食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）含量。
没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、甲基化表没食子儿茶素没食子酸酯（methyl-epigallocatechin gallate，methyl-EGCG）、甲基化表儿茶素没食子酸酯（methyl-epicatechin gallate，methyl-ECG）、茶没食子素、茶叶碱、可可碱通过核对HMDB、Metlin和MassBank数据库并结合文献[20-21]进行初步定性，并与标准品比对保留时间、精确质量数及碎片信息定性。
质谱条件[22]：电喷雾离子肼，负离子模式鉴定上述儿茶素组分、茶没食子素；正离子模式鉴定茶叶碱和可可碱。全扫描模式，m/z 100～1 200；喷雾压力60.00 psi；气流11.00 L/min；干燥温度365 ℃，毛细管电压3 500 V。
1.3.2.3 DPPH自由基清除能力测定
DPPH溶液的配制：将20 mg DPPH粉末加入一定甲醇进行溶解，然后加甲醇定容至250 mL，配制成0.02 mmol/L。
配制梯度质量浓度的茶树花提取液：根据GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》，以体积分数70%甲醇溶液对茶树花进行提取，并且用甲醇将茶树花提取物稀释成梯度质量浓度（2、4、6、8、10 mg/mL）。
DPPH分子有一个很稳定的氮中心自由基，在517 nm波长处有强吸收，可利用紫外-可见分光光度仪测定其在517 nm波长处的吸光度。抗氧化剂茶树花提取物提供的电子能与该自由基配对结合，特征吸收消失，因此可用于评价清除自由基的能力。分别将2 mL DPPH溶液及2 mL甲醇、2 mL DPPH溶液及2 mL茶树花提取液、2 mL甲醇及2 mL茶树花提取液混合，摇匀后避光静置30 min，于517 nm波长处测定吸光度A0、As、Ar[23]。按下式计算DPPH自由基清除率。
以DPPH自由基清除率为纵坐标，茶树花提取液的质量浓度梯度为横坐标，绘制标准曲线，并根据标准曲线公式计算出清除率为50%时茶树花提取液质量浓度。本实验以抗氧化剂（茶树花提取物）的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）表示其清除DPPH自由基能力，IC50是指能够清除50% DPPH自由基的茶汤质量浓度，IC50越低表示其抗氧化能力越强。
1.3.3 茶树花感官审评
根据GB/T 23776—2009《茶叶感官审评方法》[24]中花茶的审评方法，外形得分占20%，香气占得分35%，汤色得分占5%，滋味得分占30%，叶底得分占10%，以加权方式计算总分。
1.4 数据处理与分析
HPLC-MS数据采用ESI Compass 1.3软件分析，HPLC数据采用Empower 3软件分析。所有的实验数据运用Excel软件作图，并通过SPSS软件进行单因素方差分析、S-N-K检验、Pearson相关性分析。
2 结果与分析
2.1 干燥工艺对茶树花内含代谢物的影响
2.1.1 干燥工艺对常规内含物的影响
为了维持花朵的外形并减少花粉裸露，茶树花脱水过程中不施加任何压力与揉捻工序，因此3 种工艺的水浸出物含量差异并不显著，约为500 mg/g左右（表1）。茶树花中茶多酚的含量根据工艺处理不同而呈现出显著差异，真空冷冻干燥（142.8 mg/g）＞微波烘干（119.9 mg/g）＞炒青烘干（109.2 mg/g），说明真空冷冻干燥是保留茶树花中茶多酚的最有效方法；微波烘干虽然可以短时高效破坏酶活性，防止代谢产物发生酶促氧化，但是该工艺后期物料会经历短暂的升温过程，这个升温阶段会部分促进茶多酚氧化，因此微波烘干处理的茶多酚含量较真空冷冻处理显著减少；相较于微波干燥处理，炒青烘干虽然也是通过高温钝化酶活性，但是由于杀青锅的金属介质导热效率低于微波，因此在达到酶钝化的温度之前，内含物质经历了更漫长的升温氧化过程，因此炒青烘干的茶树花茶中茶多酚含量最低。炒青烘干和微波烘干处理并不会造成游离氨基酸含量减少，因此炒青烘干和微波烘干的茶树花中游离氨基酸含量差异不显著，约为15 mg/g；但是这两种工艺后期均使用热风干燥技术，热风干燥会促进氨基酸与糖类化合物发生美拉德反应，因此这两种工艺的游离氨基酸含量显著低于真空冷冻干燥工艺。
表1 不同干燥工艺条件下茶树花主要内含物质的含量
Table 1 Contents of major components in tea plant flowers under different processing treatments
注：同列肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。表2、3同。
游离氨基酸含量/（mg/g）炒青烘干 527.5±25.3a 109.2±2.7a 14.5±0.3a微波烘干 505.2±24.4a 119.9±2.6b 15.3±0.6a真空冷冻干燥 491.4±37.7a 142.8±4.3c 17.1±0.3b干燥工艺 水浸出物含量/（mg/g）茶多酚含量/（mg/g）
2.1.2 干燥工艺对儿茶素含量的影响
特异品种的茶树组织器官中存在天然的甲基化儿茶素，例如methyl-EGCG和methyl-ECG。本研究通过三重四极杆质谱的碎片信息结合DAD二极管检测器的儿茶素和甲基化儿茶素特征光谱分析，在‘黄金桂’品种茶树花中均发现了这两种甲基化儿茶素。HPLC分析发现，茶树花中methyl-EGCG、儿茶素没食子酸酯（catechin gallate，CG）与黄酮醇糖苷类化合物在相同的保留时间出峰，存在共析出现象，因此不予定量分析。本实验共定性鉴定出9 种儿茶素，定量分析以下7 种儿茶素：GC、EGC、(＋)-C、EC、EGCG、没食子儿茶素没食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、ECG、methyl-ECG。
表2 不同干燥工艺条件对茶树花中儿茶素的影响
Table 2 Contents of cathchins in tea plant flowers under different processing treatments mg/g
注：同行肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
组分 炒青烘干 微波烘干 真空冷冻干燥GC含量 15.85±0.11b 16.39±0.46a 14.80±0.23c EGC含量 16.42±0.04c 17.22±0.51b 20.66±0.46a(＋)-C含量 4.38±0.02b 4.44±0.05b 4.63±0.04a EC含量 5.55±0.11b 5.81±0.17b 8.17±0.11a EGCG含量 10.52±0.33b 10.97±1.00b 15.27±1.87a GCG含量 3.44±0.11a 3.16±0.17a 3.34±0.11a ECG含量 5.65±0.09c 6.52±0.38b 13.63±0.57a methyl-ECG含量 2.26±0.01a 2.27±0.06a 2.52±0.07a儿茶素总量 63.91±0.10b 66.78±0.35b 83.02±0.43a
研究表明加热干燥会促进茶树花体内儿茶素的分解与氧化[6]，体外模拟实验表明EC和EGC在30～90 ℃下最不稳定[25]，它们与EGCG、ECG、(＋)-C氧化降解的速率从高到低依次为EGC≈EGCG＞ECG＞EC＞(＋)-C[26]。因此，真空冷冻干燥处理下，EGCG、EC、ECG、EGC含量均显著高于微波烘干和炒青烘干（表2）。真空冷冻干燥是减少茶树花中儿茶素降解、氧化、异构化的最有效途径之一，干燥处理温度越高，儿茶素的减少量越多[6]。茶树花中含量最高的为EGC，其次为EGCG、GC、ECG、EC、(＋)-C、methyl-ECG。茶树鲜叶中含量最高的为EGCG，其次为EGC、ECG[27]，茶树叶片与花中虽然儿茶素的组成一致，各儿茶素占比不同，叶片以酯型儿茶素为主，花以非酯型儿茶素为主。
2.1.3 干燥工艺对酚酸和生物碱的影响
茶没食子素属于重要的酚酸类衍生物，其对温度不敏感，因此3 种工艺处理下茶树花中茶没食子素含量差异不显著（图1）。没食子酸是茶叶体内含量最高的酚酸类化合物，同时没食子酸是酯型儿茶素降解成非酯型儿茶素的重要产物。由图1可看出，炒青烘干和微波烘干处理的茶树花没食子酸含量显著高于真空冷冻干燥，同时酯型儿茶素（ECG、EGCG）含量显著低于真空冷冻干燥（表2），说明酯型儿茶素在热处理过程中发生了降解并释放出大量的没食子酸。
图1 不同干燥工艺条件下茶没食子素和没食子酸含量
Fig. 1 Contents of theogallin and gallic acid in tea plant flowers under different processing treatments
图2 不同干燥工艺条件下生物碱含量
Fig. 2 Contents of alkaloids in tea plant flowers under different processing treatments
咖啡碱、可可碱和茶叶碱是茶树中重要的生物碱，咖啡碱存在所有的茶树体内，而可可碱和茶叶碱仅特异性存在于部分茶树品种中。本研究发现‘黄金桂’品种的茶树花中同时含有这3 种生物碱（图2）。茶树花中含量最高的是咖啡碱（10.7～11.1 mg/g），可可碱（1.3～1.5 mg/g）和茶叶碱（1.3～1.4 mg/g）含量明显低于咖啡碱。在这3 种工艺处理下咖啡碱稳定存在，未发生明显变化。真空冷冻干燥处理的茶树花中可可碱含量显著高于其他2 组处理；微波烘干处理的茶叶碱含量与炒青烘干处理、真空冷冻干燥处理差异均不显著。整体而言，与儿茶素、没食子酸相比，不同干燥工艺处理下茶树花的生物碱相对稳定存在。
2.2 干燥工艺对茶树花DPPH自由基清除能力的影响
不同干燥工艺处理后茶树花DPPH自由基清除能力的IC50差异均达到显著水平（表3）。IC50越低表示其抗氧化能力越强。对DPPH自由基清除作用强弱依次为真空冷冻干燥＞微波烘干＞炒青烘干，IC50与2.1.1节中茶多酚含量呈显著负相关（r＝-0.942），茶多酚含量越高，IC50越低，自由基清除能力越强。这说明低温冷冻过程中，多元酚类化合物的氧化受到抑制，儿茶素组分最接近原始状态。多酚类化合物具有抗氧化活性，因此其含量与DPPH自由基清除作用的IC50成反比。
表3 不同干燥工艺茶树花的茶汤浓度对DPPH自由基清除能力的标准曲线与IC50
Table 3 Standard curves and half maximal inhibitory concentration for DPPH radical scavenging capacity of tea plant flowers under different processing treatments
干燥工艺 标准曲线 IC50/（mg/mL）炒青烘干 y＝0.110 9x+0.143 8，R2＝0.882 4 3.205c微波烘干 y＝0.112 8x+0.176 3，R2＝0.859 1 2.995b真空冷冻干燥 y＝0.112 9x+0.161 8，R2＝0.883 6 2.865a
2.3 干燥工艺对茶树花感官风味的影响
通过感官审评发现，这3 种干燥工艺条件下，成品茶树花茶均带有麻涩的滋味；但是3 种处理下，风味品质又各有特征（表4）。真空冷冻干燥完整地保留了茶树花的外形和香气，由于未经过高温杀青处理，滋味不及其他两种干燥工艺浓醇，同时香气中带有青气。而炒青烘干和微波烘干处理后的茶树花茶均带有甜玉米香气，而且炒青的香气更浓郁。研究中发现茶树花在热干燥处理后呈现出玉米香，这可能是‘黄金桂’品种茶树花所具有的特征香气，并且需要热处理来激发诱导产生这种甜玉米香，因此真空冷冻干燥处理无法产生这种香型。
3 讨 论
3.1 茶树花的代谢产物丰富
花作为植物的生殖器官，包含了丰富的次级代谢产物。茶树花不仅含有丰富的儿茶素、茶没食子素、咖啡碱等，也在特定的品种‘黄金桂’中发现了稀有的可可碱和茶叶碱。实验也直接证明茶树花具有DPPH自由基清除能力。另外，茶树花中富含的抗氧化酶例如多酚氧化酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶的均对人体有很好的保健功效，EGCG等酯型儿茶素和EGC等非酯型儿茶素也被证明具有优异的保健性能[28]。实验证明儿茶素等物质容易受到加热作用而氧化降解，因此，最大限度地保留功能性化合物的活性是加工过程中必须衡量的问题之一。前人的研究与本研究共同证明了相比较热处理的方式，真空冷冻干燥是保持茶树花中功能性化合物活性的最有效方法。
3.2 茶树花茶的感官风味
大量研究证明茶树花茶的保健功效、感官风味仍是其作为食品的关键考核因子。冷冻干燥虽然能保存功能性成分，但是由于没有经过高温杀青处理，成品带有青气；不论使用何种加工方式，茶树花茶按照感官审评方式冲泡，滋味总是会麻舌涩口，这在其他研究[9]中也有报道。涩口的不足应该从泡饮方式上进行优化，这需要后续设计冲泡实验来解决。相比较于滋味的不足，烘干的茶树花茶香气甜香浓郁似玉米香，冻干的茶树花有青花香，其各有特色。所以在冲泡时科学地扬长避短，才能够让大众接受这款新饮品。
杀青烘干和微波烘干处理茶树花的水煮玉米香，是茶树原料加工成产品后罕见的香型，而且仅发生在高温热处理的样品中。其他食品也发现了这种现象，高温热脱水处理（温度高于80 ℃）的食品呈现类似玉米香。例如与盐水鸭、水煮鸭相比，烤鸭中未氧化的鸭脂具有较高的甜玉米气味[29]；高压蒸煮后热脱水干燥的即食型扇贝柱在贮藏早期通过定量描述法得到地气味描述词为甜味、煮玉米味[30]，这个时期的挥发性成分为硫醚类[31]；意面脱水干燥过程中采用最高温度82 ℃时也表现出高品质的玉米香[32]。这些研究用详实的数据指出二甲硫（醚）是关键的呈香因子。高温脱水处理产生的二甲硫被认为是还原糖与甲硫氨酸（蛋氨酸）发生美拉德反应的产物[33]。二甲硫（醚）在茶叶，特别是在烘炒的绿茶中也有发现，茶叶风味化学描述其为“新茶香”。茶树花在花瓣露白和完全展开时期均未检测到二甲硫（醚）[34]，推断由于茶树花蛋白质与还原糖含量显著高于叶片，因此二甲硫（醚）在热脱水过程中大量富集而形成玉米香，本研究后续也会开展相关工作验证这个结论。
表4 不同干燥工艺的茶树花感官特征
Table 4 Sensory profiles of tea plant flowers under different processing treatments
干燥工艺 外形评价 得分 香气评价 得分 色泽评价 得分 滋味评价 得分 叶底评价 得分 总分炒青烘干 卷曲紧结，褐色，尚匀整 85 甜玉米香，略显青气 85 橙黄明亮 82 醇厚略麻涩 77 红褐色，尚完整，软嫩 78 81.75微波烘干 卷曲紧结，青黄，匀整 88 淡甜玉米香 86 淡杏黄色，明亮 82 醇正带麻涩 72 米黄色，完整，软嫩 83 81.70真空冷冻 自然成朵，淡黄，匀整 90 清花香持久，带青气 88 淡杏黄色，明亮 85 甜醇有麻涩 70 淡黄色，完整，软嫩 85 82.55
3.3 开发茶树花茶的产业效益
开发茶树花产品意义重大。以产茶大县安溪为例，截至2018年底，该县茶园面积60万 hm2，以亩产100 kg茶树花计算，全县可生产茶树花茶1.5万 t。茶树花的饮用及活性物质利用不仅能够实现资源利用，还能够改变单一的茶叶生产模式，延伸当地上游茶产业链，具有经济效益和社会效益。10月中旬至11月中旬是茶树花的盛花期，而这个时期安溪茶农处于农闲时期，通过采收茶花，既减少茶树的营养消耗，又能带来可观的经济效益。因此，本研究作为开发利用安溪当地茶树干花制品的基础性研究，希望能够促进安溪当地茶树花资源的开发和利用，为其开发茶树花产品提供理论依据和数据参考。
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