肉类含有丰富的优质蛋白质，相比植物蛋白，肉类蛋白中必需氨基酸的组成更加均衡，更易于消化吸收，通常被认为是全价蛋白质[1]，营养价值高[2]，且肉类蛋白质氨基酸组成成分与维持机体细胞、组织成长所需的氨基酸种类和比例十分相近[3]，在机体生长发育和物种进化中发挥着重要作用[2]。肠道微生物被认为是人体的至关重要的“第二基因组”[4]，近年来得到广泛的关注。人体肠道微生物有上千种[5]，其中厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、梭杆菌门（Fusobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia）是人体肠道中6 种优势菌门[6]。肠道微生物可以发酵未消化的食物（膳食纤维、蛋白质），生成的代谢产物对人体健康具有重要的影响[4]。
研究发现，素食爱好者和肉食爱好者的肠道菌群结构有着明显的差异，素食爱好者体内肠道菌群优势菌种为多枝梭菌和产气荚膜梭菌，而食肉者肠道优势菌群为普拉氏梭杆菌[7]。Qi Hongwei等[7]用不同来源的蛋白质作为唯一膳食蛋白配制饲料喂大鼠，14 d后检测盲肠内容物中微生物的组成，发现不同种类植物蛋白质对大鼠盲肠内容物中微生物组成有着显著的影响。Zhu Yingying等[8]以鸡肉蛋白、牛肉蛋白和大豆蛋白喂养大鼠90 d，对微生物组成结构和代谢物进行分析，显示鸡肉蛋白组乳酸杆菌丰度较高、乳酸增加、大豆蛋白乳酸杆菌降低，并证实了肉类的适当摄入可减少人体炎症的发生。实验动物与人体环境存在一定的差异，直接用人体开展食肉对肠道微生物影响的研究甚少。
本实验在体外发酵的条件下，采集45 名健康成年人（18～28 岁）的粪便微生物与牛肉和鸡肉蛋白发酵，分析2 种肉蛋白对人体肠道微生物组成和结构的影响，旨在为后期开展研究人类健康合理膳食提供一定的理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜牛肉、鸡肉购于苏果超市专营店；培养基基础母液为实验室自制；QIAamp DNA Stool Mini Kit 德国Qiagen公司；其他试剂为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
高压蒸汽灭菌锅 日本Tomy公司；Precellys均质机法国Bertin Technologies公司；微型旋涡混合仪 上海泸西分析仪器厂；MlX-206微型离心机 美国Crystal公司；电子天平 上海精密科学仪器公司；制冰机 日本三洋公司；恒温振荡金属浴 上海珂淮仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 肉蛋白粉的制备和体外消化
肉蛋白粉制作和体外消化参考文献[9]。将牛外脊肉和鸡胸肉剔除可见结缔组织和脂肪，绞碎后放入蒸煮袋中，水浴加热至中心温度70 ℃。冷却至室温后冻结，进一步冷冻干燥处理去除水分。每100 g冻干肉粉加入1.5 L二氯甲烷-甲醇混合液（2∶1，V/V），混合均匀后抽提处理2～3 次，挥干有机溶剂后过35 目筛，肉蛋白粉加入制备好的消化液（胃酶和胰酶）得到产物沉淀，真空冷冻干燥后使用。
1.3.2 基础液体培养基的制备
参考文献[10]方法，培养基母液由以下7 种溶液组成，配制方法如下：
碳酸氢盐溶液：准确称取65 g NaHCO3加入到1 L烧杯中溶解，持续通入CO2气体，现配现用。使用前再次通气20 min。
微量元素溶液：依次准确称量2 5 m g MnCl2·4H2O、20 mg FeSO4·7H2O、25 mg ZnCl2、50 mg CuCl2·2H2O、50 mg CoCl2·6H2O、50 mg SeO2、250 mg NiCl2·6H2O、250 mg Na2MoO4·2H2O、31.3 mg NaVO3和250 mg H3BO3加入到50 mL烧杯中，用20 mL 0.02 mol/L HCl溶液溶解，转移至1 L容量瓶中用超纯水定容，再分装到2 个500 mL棕色瓶中，4 ℃保存备用。
磷酸盐溶液：准确称取54.7 g KH2PO4试剂，溶于1 L超纯水中，之后向KH2PO4溶液中加入20.4 mg生物素、20.5 mg叶酸、164 mg泛酸钙、164 mg烟酰胺、164 mg核黄素、164 mg盐酸硫胺、164 mg盐酸吡哆醇、20.4 mg对氨基苯甲酸、20.5 mg钴胺素。2.2 μm滤膜过滤除菌，滤液置于加盖的灭菌血清瓶中密封，4 ℃保存，两周内用完。
脂肪酸溶液：准确称取8 g NaOH加入到50 mL烧杯中，用少量超纯水溶解，之后转移至1 L容量瓶中，加入800 mL以上的水，摇匀后加入6.85 mL 156.64 mmol/L乙酸溶液、3.00 mL 51.78 mmol/L丙酸溶液、1.84 mL 20.26 mmol/L丁酸溶液和0.55 mL 20.99 mmol/L戊酸溶液定容至1 L，再分装到2 个500 mL棕色瓶中，4 ℃保存备用。
刃天青溶液：作为厌氧指示剂，有游离氧存在时呈红色，无氧时呈无色。准确称取100 mg刃天青，溶于100 mL超纯水中，4 ℃保存备用。
氯化血红素溶液：准确称取0.1 g氯高铁血红素加入到50 mL烧杯中，烧杯置于沸水中，加入5 mL 0.05 mol/L的NaOH溶液溶解，转移至500 mL容量瓶中持续通入CO2气体，沸水定容，定容过程中持续通入CO2气体。分装到3 个血清瓶中，4 ℃保存备用。
还原剂溶液：准确称取20.5 g Na2S·9H2O加入到50 mL烧杯中，用少量水溶解后转移到1 L容量瓶中，使用沸水定容，定容过程中持续通入CO2气体。2.2 μm滤膜过滤除菌，滤液置于加盖的灭菌血清瓶中密封，4 ℃保存。
量取920 mL超纯水至三角瓶中，依次准确称量0.6 g KCl、0.6 g NaCl、0.2 g CaCl2·2H2O、0.5 g MgSO4·7H2O、1.46 g KH2PO4、3.55 g Na2HPO4、4.0 g葡萄糖至三角瓶中，溶解完毕后，依次加入10 mL微量元素溶液、10 mL氯化血红素溶液、10 mL脂肪酸溶液，放入微波炉中加热至沸腾，通入CO2至常温，再加入50 mL碳酸氢盐溶液，定量分装9 mL到已经添加有蛋白粉的发酵试管中，用橡皮塞和铝盖密封，灭菌。接种前每瓶发酵瓶中加入1 mL的还原剂和1 mL的磷酸盐溶液。
1.3.3 志愿者招募
招募本校年龄在18～28 岁男性志愿者200 名，签署知情同意书、校医院体检、填写日常生活和饮食调查问卷。选取相似生活背景和饮食习惯、健康无遗传病史和3 个月内未使用抗生素45 名男性志愿者。统一时间内收集新鲜粪便。
1.3.4 菌液的制备
在超净工作台内称量2 g新鲜粪便样品至无菌锆珠管（已加入碎珠），加入10 mL经过脱氧处理的磷酸缓冲盐溶液，4 500 r/min均质1 min，经过三层纱布过滤，制备菌液悬浮液。
1.3.5 肠道微生物的培养
实验设置对照组（1-样品编号，未加蛋白粉）和实验组，实验组中2 种蛋白质的添加量为0.01 g，共2 组，分别为牛肉蛋白组（N-样品编号）、鸡肉蛋白组（J-样品编号），每组45 个重复。在厌氧的条件下用注射器将1.3.2节制成的基础培养基和1.3.4节制得菌液9∶1（V/V）混合，充分摇匀。置于37 ℃摇床中恒温培养48 h，之后分装2 mL冻存管中，-80 ℃保存。
1.3.6 肠道微生物的DNA提取和测序
按照QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒说明书方法提取发酵液总DNA[11]，提取后的样品置于-20 ℃保存。
1.3.7 Illumina PE250测序
将1.3.6节提取出的DNA送到上海凌恩生物科技公司进行测序，步骤如下[12-17]：1）DNA纯度检测：利用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。2）聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增：在V4区富集扩增，合成barcode特异引物循环扩增（每个样本3 个重复），同一样本的PCR产物都需2%琼脂糖凝胶电泳检测；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）回收PCR产物；Tris-HCl洗脱；2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR采用TransGen AP221-02：TransStart FastPfu DNA Polymerase；PCR仪：ABI GeneAmp®9700型。3）荧光定量：PCR产物用QUAN提FluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）检测定量。4）文库构建：测序公司根据文献和公司方法构建。5）测序。
1.4 生物信息学分析
1.4.1 序列的优化
将Illumina PE250测序序列按照标签从所有样品筛选有效序列。原则和步骤如下[18-19]：1）过滤：设置50 bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的序列。2）拼接：将成对的序列拼接成一条序列，最小重叠长度为10 bp，最大错配比率为0.2，筛除不符合序列。3）校正：根据序列首尾两端的标签和引物区分样品，并调整序列方向，标签允许的错配数为0，最大引物错配数为2，最后去除嵌合体。
1.4.2 分类学分析
使用Usearch version 7.1软件（http://drive5.com/uparse/）对测序的所有序列97%的相似水平下进行可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）[12,19]划分；采用RDP classifier贝叶斯算法[20]（http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/），在置信度阈值为0.7的条件下，对OTU序列进行各个分类水平的分析，参考的比对数据库为Silva Release 119[21]（http://www.arb-silva.de）；LEfSe[22]是分析基因组特征信息的方法；统计学分析采用SAS 9.2软件统计，P＜0.05，差异显著。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
135 个样品在515F-806R（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’-5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）区域扩增至每个样品浓度都达到A，如图1所示，PCR产物目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续实验。
图1 PCR扩增序列结果图
Fig. 1 Results of PCR amplified DNA fragments
2.2 序列优化的结果
本研究共测定样品数135，总序列数6 048 811，对照组、牛肉蛋白组和鸡肉蛋白组筛选后每组平均序列数分别45 979、44 788和47 793，且3 组间无明显差异（P＞0.05）。总碱基对数为1 547 301 984 bp，平均碱基数为255.80 bp。而有效序列大多分布在251～300 bp，数量占比为99.999 7%。
2.3 样本的多样性
图2 稀释性曲线
Fig. 2 Rarefaction curves
稀释性曲线可以用来比较不同测序量样本中物种的丰度，反映样本的测序深度。由图2可知，随着测序量的增加，样本物种的丰度也在增加，测序深度也在增加。Shannon-Wiener曲线是利用各样本的测序量在不同测序深度时微生物的多样性指数，反映不同测序量样本中微生物的多样性，Shannon指数越大，代表样本微生物多样性越高。由图3可知，随着OTU数量的增加，Shannon-Wiener曲线趋向平坦，说明测序量已达到饱和。因此认为此测序方法可行，可以反映样本中微生物大部分的信息。
图3 Shannon-Wiener曲线
Fig. 3 Shannon-Wiener curves
2.4 菌群组成和相对丰度分析
表1 门水平菌落相对丰度
Table 1 Abundance of gut microbiota at the phylum level%
注：同行不同肩标字母表示差异显著（P＜0.05）。
images/BZ_132_1299_1800_2276_1848.png放线菌门 1.35±4.27a 3.46±3.23b 3.03±2.65b拟杆菌门 55.66±15.19a 50.22±16.89ab 47.58±17.28b厚壁菌门 37.46±12.41a 33.95±14.44a 35.29±16.23a梭杆菌门 1.10±3.88a 0.69±1.86a 0.54±1.29a变形菌门 4.21±3.77a 11.61±14.42b 13.47±15.70b疣微菌门 0.04±0.11a 0.02±0.05a 0.04±0.10a
由表1可知，在门水平上，实验组在拟杆菌门、变形菌门和放线菌门相对丰度有显著变化（P＜0.05）。与对照组相比，牛肉蛋白组变形菌门和放线菌门相对丰度显著增加；鸡肉蛋白组变形菌门和放线菌门相对丰度也显著增加，但拟杆菌门的相对丰度却显著减小。牛肉蛋白组和鸡肉蛋白组之间无显著差异（P＞0.05）。说明在门水平上，肉蛋白组显著改变人体粪便微生物相对丰度。
2.5 不同组别菌群的聚类分析
聚类树显示在组间样品中微生物相似度的聚类分析，由图4聚类树可知，对照组和牛肉蛋白样本可以明显区分。由图4柱状图可知，对照组和牛肉蛋白组优势菌门主要有拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门。且a和b区域的柱状图看出，与对照组相比，牛肉蛋白组变形菌门和放线菌门相对丰度显著增加（P＜0.05）；拟杆菌门相对丰度整体较高，但无显著差异（P＞0.05）。
图4 对照组和牛肉蛋白样本聚类树和柱状图
Fig. 4 Clustering dendrogram and histogram for control versus beef protein groups
图5 对照组和鸡肉蛋白样本聚类树和柱状图
Fig. 5 Clustering dendrogram and histogram for control versus beef protein groups
由图5可知，对照组和鸡肉蛋白组优势菌群也是拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门，且2 组菌门组成差异显著，样本聚类明显区分。从柱状图方框处可以看出，与对照组相比鸡肉蛋白组变形菌门、放线菌门相对丰度显著增加，拟杆菌门相对丰度显著降低，并且变形菌门变化最明显。
图6 牛肉蛋白和鸡肉蛋白组样本聚类树和柱状图
Fig. 6 Clustering dendrogram and histogram for beef versus chicken protein groups
如图6所示，牛肉蛋白和鸡肉蛋白2 组样本微生物分布不均匀。门水平上，牛肉蛋白和鸡肉蛋白组肠道微生物组成和相对丰度没有明显的差异。由图6聚类树可知，a区域同一样本在经过牛肉蛋白和鸡肉蛋白处理后肠道微生物相似度较高，比如NC7和JC7，说明个体差异大于组间差异。同时图6柱状图显示，b区域变形菌门相对丰度较高，拟杆菌门相对丰度较低。a区域也出现和b区域类似的情况，但变形菌门相对丰度减少，拟杆菌门相对丰度增加。牛肉蛋白和鸡肉蛋白组肠道微生物组成和相对丰度没有显著差异。
2.6 组间LEfSe分析
LEfSe分析是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的方法[23]，用于区分两个或以上生物条件下，强调统计意义和生物相关性。采用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）估算每个组分相对丰度对差异影响的大小，并且找出这些微生物。
与对照组相比，牛肉蛋白组影响组间差异的菌共有89 种，其相对丰度和LDA值见图7。选择图7B中影响对照组和牛肉蛋白组差异相对丰度前十（LDA数值前十，根据菌门分类），并且对组间差异起重要作用的组分，分别是梭菌属（Clostridia）、梭菌科（Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、疣微菌科（R u m i n o c o c c a c e a e）、普氏菌属（Prevotella 9）、Selenomonadales、Negativicutes、韦荣氏菌科（V e i l l o n e l l a c e a e）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、Proteobacteria。如图7A所示，将10 组微生物进行门水平分类，拟杆菌门：普氏菌属；变形菌门：肠杆菌科、Proteobacteria，其他都为厚壁菌门。其他水平分类：目水平：Selenomonadales；科水平：梭菌科、毛螺菌科、疣微菌科、韦荣氏菌科、肠杆菌科；属水平：梭菌属、Negativicutes、普氏菌属。
与对照组相比，鸡肉蛋白组影响组间差异的菌也有89 种，其相对丰度和LDA值见图8。选择图8B中影响对照组和鸡肉蛋白组差异相对丰度前十（LDA数值前十，根据菌门分类），并且对组间差异起重要作用的组分，分别是梭菌属、梭菌科、Selenomonadales、Negativicutes、毛螺菌科、韦荣氏菌科、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、普氏菌属和Proteobacteria。如图8A所示，将10 组微生物进行门水平分类，拟杆菌门：普氏菌属和普雷沃氏菌科；变形菌门：Proteobacteria；其他都为厚壁菌门。其他水平分类：目水平：Selenomonadales；科水平：梭菌科、毛螺菌科、韦荣氏菌科、普雷沃氏菌科、疣微菌科；属水平：梭菌属、Negativicutes、普氏菌属。
图7 对照组和牛肉蛋白组LEfSe分析（A）和LDA（B）
Fig. 7 LEfSe analysis (A) and LDA (B) between control and beef protein groups
图8 对照组和鸡肉蛋白组LEfSe分析（A）和LDA（B）
Fig. 8 LEfSe analysis (A) and LDA (B) between control and chicken protein groups
综合图7、8，牛肉蛋白和鸡肉蛋白组没有找到差异菌种。综上所述：对照组分别和实验组相比差异结果的菌群都有89 种。影响差异结果主要来源于厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门。
2.7 核心菌属的分析
表2 15 种核心菌属的相对丰度
Table 2 Percent abundance of 15 core species%
注：同行不同肩标字母差异显著，P＜0.05。
images/BZ_136_224_581_1204_628.pngVeillonella 0.20±0.52a 1.29±4.09a 1.32±4.52a Sutterella 0.748±0.99a 1.62±2.36ab 1.33±2.00b Streptococcus 0.62±1.88a 1.37±3.63a 1.13±3.27a Prevotella 9 12.42±21.38a 3.72±9.33b 5.33±13.15b Phascolarctobacterium 1.45±2.07a 2.18±2.96a 1.76±2.05a Parabacteroides 2.26±1.91a 1.57±1.19b 1.53±1.26b Megasphaera 1.15±2.97a 7.12±12.20b 5.66±9.83b Megamonas 0.67±2.42a 4.60±9.43b 3.92±9.23b Lactobacillus 0.23±0.94a 1.37±3.87a 1.64±5.06a Faecalibacterium 6.33±5.10a 2.67±2.29b 2.52±2.15b Escherichia-Shigella 1.11±2.61a 8.01±13.72b 6.99±12.71b Dialister 1.91±2.91a 2.54±4.25a 2.85±4.24a Bifidobacterium 1.15±4.21a 2.02±2.12a 2.15±2.20a Bacteroides 34.50±19.96a 39.86±20.38a 40.89±21.26a[Ruminococcus] torques group 0.48±0.53a 1.48±2.65ab 1.17±1.76b
图9 样品核心菌群在属水平上分布情况
Fig. 9 Distribution of core microbiota at genus level
将3 个组别共135 个样本，属水平上相对丰度超过1%定义为优势菌属[24]，并且选择共有菌属为核心菌属，共发现15 种核心菌属（表2和图9）。菌属相对丰度排名前五（以2 个实验组为准排序）分别为拟杆菌属（Bacteroides）、大肠杆菌-志贺菌（Escherichia-Shigella）、巨球型菌属（Megasphaera）、巨单胞菌属（Megamonas）和普氏菌属（Prevotella 9）。
与对照组相比，牛肉蛋白组普氏菌属、Parabacteroides、Faecalibacterium 3 种菌属相对丰度显著降低；巨球型菌属、巨单胞菌属和大肠杆菌-志贺菌显著增加。鸡肉蛋白组普氏菌属、Parabacteroides、Faecalibacterium相对丰度也出现明显的降低；巨球型菌属、巨单胞菌属和大肠杆菌-志贺菌、萨特氏菌属（Sutterella）、瘤胃球菌组（[Ruminococcus] torques group）类相对丰度显著增加。牛肉蛋白组和鸡肉蛋白组菌属相对丰度没有显著差异。
有益菌属双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳酸杆菌（Lactobacillus）的相对丰度却很低，且在3 个组内未出现显著差异。虽然有益菌含量较低，但是和对照组相比，实验组的菌群相对丰度是增加的，说明人体适当吃肉有益肠道有益菌的生长。
3 讨 论
本研究是在体外发酵条件下，采集45 名相似生活背景、饮食习惯，身体健康的大学生的粪便，添加牛肉蛋白和鸡肉蛋白与之共培养48 h，利用高通量测序分析粪便微生物的组成和结构的变化。结果显示微生物定殖在2 种肉蛋白中，微生物的菌群种类和结构发生明显的变化，但牛肉蛋白组和鸡肉蛋白组相比，粪便微生物组无明显的差异。
45 名志愿者粪便微生物优势菌门拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和梭杆菌门、疣微菌门，与之前研究结果一致[25]。本实验结果表明肉蛋白影响人粪便微生物的组成和结构，这与Zhu Yingying等[26-28]研究发现小鼠摄食正常肉蛋白会影响肠道菌群的组成和结构的结论相似，说明实验结果具有一定的可靠性。
与对照组相比，肉蛋白组都显著增加了变形菌门、放线菌门的相对丰度，鸡肉蛋白组还降低了拟杆菌门的相对丰度。肠道微生物利用培养基的唯一氮源肉蛋白改变了自我生长状况，其组成和结构也发生明显的差异。但牛肉蛋白和鸡肉蛋白组粪便微生物未发生明显的变化，可能由于牛肉蛋白和鸡肉蛋白氨基酸种类差异较小、肌纤维蛋白和肌浆蛋白组成相似，使得微生物利用状况相似，对微生物的相对丰度和种类的影响较小[29-30]。另一种可能是人类个体差异大于组间差异，人体肠道菌群的种类受饮食的影响，宿主基因型、年龄等多个因素的影响[31-33]。
与对照组相比，添加牛肉蛋白和鸡肉蛋白组分在微生物属水平上有一定的差异性。鸡肉蛋白组不仅显著变化跟牛肉蛋白组相同的菌属，另外还显著降低了萨特氏菌属和瘤胃球菌的相对丰度。鸡肉蛋白和牛肉蛋白在人体内蛋白消化吸收不同[30]。普氏菌属主要利用的底物是糖类物质[34]，当添加肉蛋白作为唯一蛋白来源，其相对丰度发生明显的变化；Faecalibacterium是人体内重要的共生菌，发酵底物是膳食纤维产生丁酸和短链脂肪酸[35]。双歧杆菌和乳酸杆菌2 种有益菌属在鸡肉蛋白组和牛肉蛋白组相对丰度分别为2.15%、1.64%和2.02%、1.37%，添加肉蛋白后其相对丰度有所增加，说明肉蛋白可以促进有益菌属的生长，为人合理健康膳食提供一定的依据。
4 结 论
探讨牛肉和鸡肉蛋白对人粪便微生物组成和结构影响，对连接膳食和人体健康关系有着重要的意义和科学价值。本实验结果表明，肉蛋白明显影响肠道微生物的浓度和组成，鸡肉蛋白和牛肉蛋白虽然在组成上相似，但两者影响也有所差异。临床上牛肉和鸡肉膳食如何对人体健康、组织结构、生长情况产生影响有待进一步的研究。
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