乳和乳制品由于其富含蛋白质、乳糖、矿物质和维生素等营养物质，目前已经成为人们饮食结构当中重要的组成部分[1]。许多国家人们都在大量的消费乳制品，但是常见的鲜乳或乳粉中功能活性物质的种类较少，已经不能满足现代消费者对于营养保健的需要。而发酵乳制品不仅保留了原乳的营养品质，并且经过发酵后具有良好的风味以及能产生多种有益健康的功能成分，如乳酸菌代谢产生多种人体必须的维生素，可以满足人体的营养需要，同时还可产生多种酶类、多肽类和多糖类等，不仅具有清除自由基起到抗氧化延缓衰老的作用，而且还具有提高机体免疫力、维持肠道菌群平衡、防止便秘、降低胆固醇[2]、降血压及抗癌等多种功效[3-5]。此外还能通过发酵过程中分解乳中的乳糖，从而缓解由于乳糖不耐症所引起的腹痛、腹泄等腹部不适症状。因此，目前发酵乳已经成为深受人们喜爱的功能保健食品[6-7]。
目前，国内外学者已经将多种天然产物应用于功能发酵乳的开发研究中，如沙棘[8]、蓝莓[9]、紫薯提取物[10]， 螺旋藻[11]、山核桃[12]等，用于改善发酵乳的风味和品质量，以及增加其保健功能等。同时也有许多研究将杏鲍菇多糖[13]、灵芝多糖[14]、松茸多糖[15]、红枣多糖[16]和凝胶多糖[17]等应于发酵乳的研究开发中，结果发现不仅可以改善发酵乳的感官品质，还可以提供益生菌活性以及提高发酵乳的抗氧化活性等。此外由于多数多糖化合物都具有一些特殊的生理活性，如枸杞多糖、松茸多糖、藠头多糖和松花粉多糖等具有抗氧化、免疫调节和肿瘤等功效[18]，因此将活性多糖用于功能性发酵乳的开发具有广阔的应用前景。山楂叶多糖是一种功能活性多糖，具有降血压、降血脂和抗氧化等活性功能[19-20]，目前国内对山楂叶多糖的研究仅限于提取工艺方面[20-21]， 而关于山楂叶多糖对发酵乳品质影响的研究鲜见相关报道。且河南新乡南太行山区野生山楂树资源丰富，将山楂叶变废为宝，开发山楂叶作为功能活性物质的新来源，提取山楂叶多糖用于开发功能性食品，具有广阔的市场前景。本研究以山楂叶多糖和发酵乳为研究对象，通过测定不同添加量山楂叶多糖发酵乳的乳度、乳酸菌活菌数、持水力、质构、流变和抗氧化活性等，研究山楂叶多糖对益生菌发酵乳的品质影响，为新型山楂叶多糖益生保健发酵乳的开发提供理论依据和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
山楂叶采自新乡南太行山山区；生鲜牛乳购自河南省新乡市段村奶牛养殖场。发酵剂（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌）为河南科技学院食品微生物实验室保藏。
1.1.2 试剂与培养基
水杨酸、铁氰化钾 国药集团化学试剂有限公司；硫酸亚铁 天津科密欧试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海 阿拉丁试剂有限公司；三氯乙酸 上海山浦化工有限 公司；其他试剂均为市售分析纯。
乳酸菌培养基（MRS培养基） 青岛海博生物技术有限公司。
1.2 仪器与设备
Sartious电子精密天平 北京赛多利斯天平有限 公司；SW-CJ-IBU超净工作台 苏州苏净集团；5418高速离心机 芬兰Eppendorf公司；Orion 3 STAR pH计 美国Thermo公司；GXZ-9240 MBE鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；冷冻干燥机 德国Christ公司；TA-XT.plus质构仪 英国Stable Micro Systems 公司；TU-1810型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；HH-42水浴锅 常州国华电器有限公司；HAAKEMARS流变仪 美国Thermo Scientific公司； CR-400色差计 日本美能达公司。
1.3 方法
1.3.1 山楂叶多糖提取
选取新鲜的山楂叶洗净烘干后粉碎，参考Yuan Qingxia等[22]的方法，取山楂叶干粉进行热水浸提，提取条件：温度90 ℃、添加量40 g/L、提取时间4 h。浸提结束后4 000 r/min离心20 min，收集上清液。向上清液中加入3 倍体积无水乙醇醇沉，4 ℃放置过夜， 5 000 r/min离心10 min得沉淀物。采用蒸馏水复溶沉淀后，真空冷冻干燥得到山楂叶粗多糖。山楂叶粗多糖的纯度为70.28%。
1.3.2 山楂叶多糖发酵乳制备
100 mL的鲜牛乳经65 ℃预热加入5%蔗糖溶解后，分别加入0%、0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.2%的山楂叶多糖，在95 ℃巴氏杀菌10 min，待冷却到室温后，分别接种1‰的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌复合菌粉，在42 ℃的恒温培养箱中发酵6 h，冷却后放入4 ℃冰箱后熟24 h制得山楂叶多糖益生菌发酵乳[23]，以不添加山楂叶多糖的样品为对照组。
1.3.3 乳酸菌活菌数测定
将加入不同比例山楂叶多糖的发酵乳，采用MRS平板计数法进行乳酸菌活菌数的测定[13]。
1.3.4 持水力测定
称取50 mL离心管的质量记为M0，将加入10 mL山楂叶多糖发酵乳的离心管质量记为M1。经3 000 r/min离心10 min的样品静置10 min后弃去上清液，称量质量记为M2，平行测定3 次取平均值。持水力计算如式（1）所示：
1.3.5 酸度测定
pH值测定：采用精密pH计测定。
滴定酸度测定：取冷却后熟后的添加不同比例山楂叶多糖发酵乳样品，分别取10 mL发酵乳样品于250 mL锥形瓶中，加入20 mL蒸馏水混匀，再加入适量酚酞指示剂，以0.1 mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，且30 s内不退色。记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积，乘以10即为样品的滴定酸度（吉尔涅尔度）[24]。
1.3.6 色泽测定
采用CR-400色差计测定发酵乳的L*值、a*值和b*值[25]。采用标准比色板进行校正，标准比色板为L*=97.22、a*=－0.14、b*=1.82。其中L*表示亮度值， a*表示红度值，b*表示黄度值。
1.3.7 质构测定
参考Bedani等[26]方法，略有改进。采用质构仪选择质地剖面分析测试模式和P/0.5探头对发酵乳的凝胶结构进行测定。速率分为测前2.0 mm/s、测中1.0 mm/s和测后2.0 mm/s；下压间隔时间为1 s；最小触发力为0.3 N。
1.3.8 储能模量和损失模量测定
采用HAAKEMARS流变仪测定发酵乳的储能模量和损失模量[27-28]。使用50 mm实心定转子的同心圆筒，将少量经搅拌的发酵乳样品置于流变仪上进行测定，测定条件为温度5 ℃，缝隙1 mm，固定频率（0.1～20 Hz）。
1.3.9 DPPH自由基清除能力的测定
样品均用95%乙醇溶液配制成质量浓度为0.11 g/mL溶液，向2 mL样品溶液中加入2 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液（溶解于95%乙醇溶液），于25 ℃水浴加热30 min后，在517 nm波长处测得试样吸光度（Ai）。同时以2 mL蒸馏水代替上述体系中2 mL样品测得空白吸光度（A0）。同时以2 mL 95%乙醇溶液代替上述体系中2 mL DPPH-乙醇溶液。测得样品本底吸光度（Aj），其中Ai和Aj每个样品质量浓度做3 个平行，取平均值。 按式（2）计算清除率[29]：
1.3.10 羟自由基清除能力的测定
样品均用95%乙醇溶液配制成质量浓度为0.11 g/mL溶液，向4 mL样品溶液中加入8.8 mmol/L H2O2溶液、9 mmol/L FeSO4溶液和9 mmol/L水杨酸溶液各0.5 mL，混匀，37 ℃水浴加热30 min，于510 nm波长处测定样品吸光度（Ai），将体系中的样品溶液改为加入4 mL蒸馏水，测得空白对照吸光度（A0），将加入0.5 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液代替为0.5 mL蒸馏水时，测得样品本底吸光度（Aj），其中Ai和Aj每个质量样品浓度做3 个平行，按式（3）计算羟自由基清除率[30]：
1.3.11 Fe3＋还原能力的测定
样品均用95%乙醇溶液配制成质量浓度为0.11 g/mL 溶液，向2 mL样品溶液中加入1%的铁氰化钾溶液和0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6）各2 mL，于50 ℃保温20 min后加入10%三氯乙酸溶液2 mL，3 000 r/min混合离心10 min后取上清液2 mL，加入2 mL蒸馏水和0.4 mL 0.1%三氯化铁溶液，室温反应10 min后，测定其在700 nm波长处的吸光度[31]。每个样品做3 个平行。
1.3.12 发酵乳感官评定
选取20 位有发酵乳感官评价经验的食品专业教师和同学，从色泽、组织状态、风味、口感和风味等方面，对添加不同比例山楂叶多糖的发酵乳进行感官评定，根据 表1所示的评分标准进行评分，满分为100 分，感官评分为20 人打分的平均分值[32]。
表 1 发酵乳感官评分标准
Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented milk
项目 评分标准 总分值色泽 颜色均匀一致（7～10 分） 10颜色深浅不一（4～6 分）组织状态凝固性好、无或少量乳清析出、质地均匀（25～30 分）30凝固性一般、稍有乳清析出、有分层（15～24 分）凝固性差、大量乳清析出、有大颗粒状凝块（0～14 分）口感酸甜适中、口感细腻可口（25～30 分）30酸甜一般、口感较细腻（15～24 分）过酸或过甜、口感偏涩（0～14 分）风味风味浓郁、发酵乳特有的味道浓厚（25～30 分）30风味一般、发酵乳特有的味道比较淡（15～24 分）风味较差、失去发酵乳的滋味（0～14 分）
1.4 数据处理
数据采用SPSS 20.0软件进行分析，所有实验重复3 次，结果以f s表示，显著性分析采用Duncan检验。
2 结果与分析
2.1 山楂叶多糖对发酵乳中乳酸菌活菌数的影响
表 2 山楂叶多糖对发酵中乳酸菌活菌数的影响
Table 2 Effects of HLP on viable cell count of fermented milk
注：同列字母不同表示差异显著（P＜0.05），下表同。
山楂叶多糖添加量/% 活菌数/（CFU/mL）0（4.42f 0.64）h 108d 0.04 （5.24f 0.39）h 108d 0.08 （6.96f 0.87）h 108cd 0.12 （8.83f 0.26）h 108c 0.16 （1.56f 0.52）h 109b 0.20 （4.51f 1.07）h 109a
由表2可知，随着山楂叶多糖添加量的增加，益生乳酸菌的活菌数量呈递增趋势，从4.42h 108 CFU/mL增加至4.51h 109 CFU/mL，且当山楂叶多糖添加量高于0.12%时，其益生菌活菌数显著高于对照组（P＜0.05），至添加量为0.16%时，乳酸菌活菌数达到109 CFU/mL以上，说明山楂叶多糖可以有效促进益生乳酸菌的增殖，提高发酵乳中益生乳酸菌的数量。已有研究报道天然植物多糖可以作为益生元，促进益生乳酸菌的生长[33-34]，而益生乳酸菌可以通过代谢产生维生素、多肽等功能成分，提高发酵乳的营养价值，还可抑制有害微生物的生长。因此，在发酵乳中添加山楂叶多糖可以增加益生乳酸菌的数量，提高发酵乳的益生效果。
2.2 山楂叶多糖对发酵乳持水力的影响
图 1 山楂叶多糖对发酵乳持水力的影响
Fig. 1 Effect of HLP on water-holding capacity of fermented milk
字母不同表示差异显著（P＜0.05），下图同。
由图1可知，随着山楂叶多糖添加量的增加，发酵乳的持水力呈先升高后降低的变化，不同山楂叶多糖添加量发酵乳的持水力均显著高于对照组（P＜0.05），且当山楂叶多糖添加量为0.12%时，发酵乳的持水力达到最高为60.24%。发酵乳由于其含有大量的酪蛋白，蛋白分子之间可以形成网状空间胶体结构，该结构可以容纳水分和其他小分子物质。当添加一定量多糖后，可能进一步促进了酪蛋白之间的相互作用，因此提高了持水性[35-36]。但是当山楂叶多糖添加量高于0.16%后，可能由于过量的多糖破坏了蛋白质之间的互相聚集作用，导致乳清析出增多，从而导致持水力下降[37]。本研究与已研究报道的松茸多糖和红枣多糖的研究结果基本一致，添加适量的天然多糖可以改善发酵乳的持水性，改善其组织状态，提高发酵乳的品质。
2.3 山楂叶多糖对发酵乳酸度的影响
图 2 山楂叶多糖对发酵乳滴定酸度的影响
Fig. 2 Effect of HLP on titratable acidity of fermented milk
由图2可知，随着山楂叶多糖添加量的增加，发酵乳的滴定酸度呈持续升高的趋势，且不同山楂叶多糖添加量发酵乳的滴定酸度均显著高于对照组（P＜0.05）。由于山楂叶多糖的添加可以促进发酵乳中益生乳酸菌的生长，而乳酸菌的生长过程中会利用多糖类物质进行发酵产生乳酸及其他有机酸类[38]。
图 3 山楂叶多糖对发酵乳pH值的影响
Fig. 3 Effect of HLP on pH value of fermented milk
由图3可知，随着山楂叶多糖添加量的增加，发酵乳的pH值呈持续降低的趋势，且不同山楂叶多糖添加量发酵乳的pH值均显著低于对照组（P＜0.05），这与滴定酸度的测定结果一致。发酵乳pH值的降低主要由乳酸菌生长发酵糖类物质产生有机酸引起的[39]，pH值不仅与发酵乳的风味和凝胶特性相关，还影响到食品安全[40]。适当降低发酵乳的pH值，可以改善发酵乳的风味和组织状态，而且较低的pH值可以抑制有害微生物的生长，提高发酵乳贮藏期间安全性。
2.4 山楂叶多糖对发酵乳色泽的影响
由表3可知，与对照组相比，随着山楂叶多糖添加量的增加，发酵乳的L*值逐渐降低，而a*值和b*值却逐渐升高，且添加不同质量分数山楂叶多糖发酵乳的L*、a*和b*值与对照组之间具有显著性差异（P＜0.05）。这主要因为山楂叶多糖本身具有褐色，多糖提取中掺杂了一些色素，而随着添加量的增加，导致发酵乳的颜色逐渐变暗，赋予发酵乳咖啡色的色泽。
表 3 发酵乳的色泽
Table 3 Effect of HLP on color parameter of fermented milk
山楂叶多糖添加量/% L*值 a*值 b*值0 91.49f 0.41a －2.32f 0.05f 6.72f 0.07f 0.04 89.43f 0.70b －1.61f 0.07e 8.21f 0.24e 0.08 86.73f 0.71c －1.24f 0.26d 9.39f 0.15d 0.12 84.16f 0.37d －0.59f 0.06c 10.41f 0.09c 0.16 81.65f 0.41e 0.76f 0.12b 11.38f 0.16b 0.20 78.66f 0.42f 1.35f 0.07a 12.12f 0.14a
2.5 山楂叶多糖对发酵乳质构的影响
表 4 发酵乳的质构特性
Table 4 Effect of HLP on textural properties of fermented milk
山楂叶多糖添加量/% 硬度/g 咀嚼性 黏性 内聚性0 154.12f 3.61d 91.04f 3.02d 89.12f 2.55d 0.41f 0.02c 0.04 173.72f 5.12c 94.41f 4.26d 84.42f 1.08e 0.44f 0.01b 0.08 167.54f 3.87c 102.53f 4.46c 97.31f 2.14c 0.43f 0.01b 0.12 185.07f 3.99b 115.57f 2.96b 110.89f 3.03b 0.45f 0.02b 0.16 204.91f 4.09a 139.50f 4.33a 119.33f 2.73a 0.47f 0.01a 0.20 141.34f 6.40e 94.73f 5.64d 84.46f 2.62e 0.43f 0.01b
由表4可知，随着山楂叶多糖添加量的增加，发酵乳的硬度、咀嚼性、黏性和内聚性呈现先增大后减小的变化，除0.20%添加量组，添加山楂叶多糖组的硬度均显著高于空白对照组（P＜0.05），当添加量为0.16%时，其硬度达到最大值204.91 g；同时发酵乳的咀嚼性和黏性随着硬度的变化而变化，当添加量为0.16%时，其咀嚼性、黏性和内聚性均达到最大值，分别为达到139.50、119.33和0.47。当山楂叶多糖添加量超过0.20%后，其硬度、咀嚼性、黏性和内聚性均呈现显著下降（P＜0.05）。
添加山楂叶多糖导致发酵乳质构发生变化，可能由于适量的多糖添加，有利于增强发酵乳的凝胶状态，导致其内部分子间相互作用力增强，相互聚集形成的网状结构更加稳定，增强发酵乳的硬度[41]；黏性可以使发酵乳具有更黏稠的口感，在一定的范围内，硬度和黏性高的发酵乳具有更好的口感[42]；而咀嚼性高的发酵乳会使吞咽状态的能力需求更多，赋予发酵乳一定的黏稠口感。但是添加过量的多糖后，可能会破坏分子间的相互作用，导致形成的网络结构变得不稳定，发酵乳质构变差[43]。
2.6 山楂叶多糖对发酵乳储能模量和损失模量影响
储能模量G’和损失模量G”与凝胶中作用力的大小呈正相关，G’主要表示能量高的相互作用力，而G”主要反映能量低的相互作用力。此外二者主要与发酵乳中的总固形物有关，尤其是发酵乳中蛋白质的数量和类型。如图4所示，所有的发酵乳样品在频率的变化下G’和G”都具有相似的变化趋势，可能因为样品中的总固形物含量接近，但所有发酵乳样品的G’都明显高于G”，这是凝胶网状结构所具有的典型特征，表明发酵乳形成了弱凝胶网状结构，具有黏弹性的性质[44]。添加山楂叶多糖后，发酵乳的G’和G”都发生明显的变化，随着山楂叶多糖添加量的增加，G’和G”呈递增的趋势，变化曲线逐渐高于空白对照组。G’和G”在开始阶段（频率0～1 Hz）时均快速增加，随后才呈现缓慢增加的趋势，这与Sah[27]和Haque[45]等的研究结果一致。G’主要表示每个频率变化周期贮存的能量，变高说明发酵乳体系中的相互作用力强度较高，凝胶的贮存稳定性变好。因此，添加适量的山楂叶多糖，可有效改善发酵乳的凝胶品质。
图 4 发酵乳G’（A）和G”（B）随频率变化曲线
Fig. 4 Changes in storage modulus (A) and loss modulus (B) with frequency for fermented milk
2.7 山楂叶多糖对发酵乳抗氧化性的影响
图 5 山楂叶多糖对发酵乳DPPH自由基（A）、羟自由基（B） 清除能力和Fe3＋还原能力（C）的影响
Fig. 5 Effect of HLP on DPPH (A) and hydroxyl (B) free radical scavenging ability and Fe3+ reducing power (C) of fermented milk
由图5A可知，与对照组发酵乳的DPPH自由基清除率38.4%相比，随着山楂叶多糖添加量的增加，发酵乳的DPPH自由基清除能力呈现逐渐递增的趋势，清除率最高可达到80.7%，且各处理组均显著高于空白对照组 （P＜0.05）。结果表明添加一定量的山楂叶多糖可以有效提高发酵乳的DPPH自由基清除能力。山楂叶多糖可能作为一种供氢物质，能够与自由基反应形成稳定的物质，从而阻止了DPPH自由基链式反应[46]。
由图5B可知，与对照组发酵乳的羟自由基清除率45.6%相比，随着山楂叶多糖添加量的增加，发酵乳清除羟自由基的能力呈现逐渐升高的趋势，清除率最高可达到81.6%，且各处理组和空白对照组之间羟自由基清除率具有显著差异（P＜0.05）。说明添加一定量的山楂叶多糖可以有效提高发酵乳的羟自由基清除能力。山楂叶多糖可能是一种良好的电子供体，提供给羟自由基后将其还原为OH－，从而导致羟自由基被清除。
由图5C可知，随着山楂叶多糖添加量的增加，发酵乳对Fe3＋的还原能力不断提高，且添加不同量山楂叶多糖的发酵乳的Fe3＋还原能力均显著高于对照组 （P＜0.05）。空白对照组吸光度仅为0.24，而添加山楂叶多糖的发酵乳吸光度最高达到0.56，吸光度越高，则说明发酵乳将更多的Fe3＋还原成为Fe2＋。山楂叶多糖可能为一种良好的电子供体，所提供的电子不仅可以使Fe3＋还原为Fe2＋，还可能直接与自由基物质反应生成更稳定的物质。因此山楂叶多糖的添加可以在一定程度上提高发酵乳的抗氧化能力。
2.8 山楂叶多糖对发酵乳感官品质的影响
表 5 发酵乳的感官评分
Table 5 Effect of HLP on sensory evaluation of fermented milk
山楂叶多糖添加量/% 色泽 组织状态 口感 风味 总分0 8.5 26.4 24.5 25.3 84.7 0.04 8.7 26.7 24.7 25.5 85.6 0.08 8.8 26.8 24.6 25.6 85.8 0.12 9.1 27.2 24.9 26.4 87.6 0.16 8.9 27.3 25.3 26.8 88.3 0.20 8.2 25.6 23.2 23.7 80.7
由表5可知，当山楂叶多糖在0.04%～0.16%范围时，随添加量的增加，发酵乳的感官评分呈升高趋势，且发酵乳的感官评价分数高于空白对照组，当山楂叶多糖添加量为0.16%时，发酵乳的感官评分最高，说明添加山楂叶多糖可以改善发酵乳的色泽、组织状态、风味和口感。但当山楂叶多糖添加量为0.20%时，感官评分开始下降且低于空白对照组。可能由于添加过量的山楂叶多糖会部分破坏发酵乳的组织凝胶结构，导致乳清析出过多，且发酵酸度过高，影响发酵乳的感官品质。因此，适量添加量的山楂叶多糖可以增加发酵乳的风味，改善发酵乳的组织状态，提高发酵乳的口感。
3 结 论
添加山楂叶多糖可以提高发酵乳中益生乳酸菌的活菌数、滴定酸度、持水力和抗氧化活性以及改善发酵乳色泽、储能模量、损失模量和质构特性等，当山楂叶多糖添加量为0.16%时，其硬度、黏性和咀嚼性达到最大。添加山楂叶多糖可以有效改善发酵乳的组织状态，增强发酵乳的风味，提高发酵乳的品质。
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