超声-微波法合成亚油酸β-谷甾醇酯

袁传勋,张雪茹,徐 云,郭玉华,金日生*

(合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230009)

摘 要:运用超声和微波联用的方法合成亚油酸β-谷甾醇酯,并对所得产物进行定性定量分析。通过单因试验和正交试验考察酸醇物质的量比、每次微波加热时间、微波加热次数和每次间隔超声时间对合成亚油酸β-谷甾醇酯的酯化率的影响,优化亚油酸β-谷甾醇酯的合成工艺,利用高效液相色、红外光、元分析以及核磁共振对产物进行分析并对目的产物的油溶性进行研究。结果表明:超声-微波法合成亚油酸β-谷甾醇酯的最佳工艺条件为酸醇物质的量比2.2∶1,每次微波加热时间5 min,微波加热次数4 次,每次间隔超声90 s,酯化率可达89.56%;分析鉴定结果表明所合成的物质为亚油酸β-谷甾醇酯,且纯度为98.36%。油溶性实验表明亚油酸β-谷甾醇酯在不同温度下 (5、4、25、40 ℃)于茶籽油中的溶解度是相同条件下β-谷甾醇的25 倍以上。

关键词:β-谷甾醇;亚油酸;超声;微波;酯化

植物甾醇广泛存在于植物的根、茎、叶、果实和种子中[1],是以环戊烷全氢菲为骨架的甾体类化合物[2],有降低血脂[3]和胆固醇[4]、抗癌[5-6]、抗氧化[7]、免疫[8-9]、抗 炎[10]、抗溃疡[11]等生理功能,被誉为“生命的钥匙”[12]

收稿日期:2018-12-27

基金项目:安徽省科技重大专项(16030701085);安徽大学现代生物制造协同创新中心开放基金项目(BM2016005)

第一作者简介:袁传勋(1964ü )(ORCID: 0000-0003-2464-1411),男,研究员,博士,研究方向为天然产物化学。E-mail: ycx608@sohu.com

*通信作者简介:金日生(1982ü )(ORCID: 0000-0002-2140-6507),男,助理研究员,博士,研究方向为农产品加工。E-mail: jinrisheng@hfut.edu.cn

β-谷甾醇属于植物甾醇的一种,具有很好的生理活性和安全性,不仅可以降低人体对饮食中胆固醇的吸收,还可以降低人体血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白的含量[13]。张帆[14]研究了植物甾醇对Caco-2细胞中胆固醇吸收的构效关系,研究表明这6 种植物甾醇均能浓度依赖性地降低胆固醇吸收,且作用效果为β-谷甾醇>豆 甾醇>菜油甾醇>星鱼甾醇。近年来,以β-谷甾醇为代表的植物甾醇类越来越多地应用于食品、医药、保健品等[15]行业。然而,植物甾醇类化合物微溶于油,不溶于水的特点限制了它的应用。将植物甾醇与脂肪酸进行酯化反应合成的植物甾醇酯具备植物甾醇所有的优良性能,且合成的甾醇酯对抑制人体胆固醇吸收的作用优于植物甾醇[16],另外也有研究指出植物甾醇酯能减轻非酒精性脂肪肝大鼠高脂饮食引起的肝脂肪变性[17]。与植物甾醇相比,其在油中具有更高的溶解度以及更低的熔点[18]。目前,为了进一步扩大植物甾醇的应用领域,将植物甾醇合成植物甾醇酯逐渐成为研究中的热点。

王永高[19]指出超声波产生的热效应有利于空化核的产生,可以加速酯交换反应进程,吴梅等[20]指出超声波和微波联用可以强化传质传热过程,能显著缩短酯化反应时间。本研究利用超声波辅助微波法合成亚油酸β-谷甾醇酯,合理利用超声波的强穿透力、机械搅拌作用以及空化效应[21-22],在已有微波酯化工 艺上[23-24]进行改善,与已有方法相比[25-27]合成工艺更加简单,大大缩短了酯化反应时间,酯化率高且合成过程中不使用额外催化剂和吸水剂,为后续分离纯化工艺节工省时。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

β-谷甾醇(纯度为95%) 西安全奥生物科技有限 公司;亚油酸(纯度为95%) 山东西亚化学股份有限公司;β-谷甾醇标品(纯度≥98%) 上海广锐生物科技有限公司;亚油酸β-谷甾醇酯高纯品由合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心制备,纯度≥99.5%;氘代氯仿(纯度≥99.99%) 北京迈瑞达科技有限 公司;正己烷、无水乙醇、碳酸氢钾、溴化钾均为分析纯;甲醇(色级) 德国默克公司。

1.2 仪器与设备

JJ-1B恒速电动搅拌器、JP-020超声波清洗机、EG720KG3-NR1微波炉 广东美的厨房电器制造有限公司;DZF-6050真空烘箱 上海和呈仪器制造有限公司;E2695高效液相色(high performance liquid chromatography,HPLC)仪 美国Waters 公司;Nicolet 6700傅里叶红外光(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)仪 美国Thermo Nicolet仪器 公司;Vario EL Cube元分析仪 德国Elementar公司;VNMRS600超导核磁共振波(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)仪 美国安捷伦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 单因试验

固定条件为酸醇物质的量比2∶1,每次加热4 min,微波加热3 次,每两次加热之间 品置于超声仪(120 W,80 ℃)中超声60 s。固定其他因水平,分别考察酸醇物质的量比(0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1)、每次微波加热时间(1、2、3、4、5、6 min)、微波加热次数(1、2、3、4、5、6 次)、每两次加热之间品置于超声仪(120 W,80 ℃)中超声时间(0、30、60、90、120、150 s)对酯化率的影响。

1.3.2 正交试验

根据单因试验结果,选定合适的因水平,以酯化率为指标,进行正交试验,优化亚油酸β-谷甾醇酯合成工艺,正交试验设计见表1。

表 1 L9(34)正交试验因素与水平
Table 1 Level of independent variables used for L9(34) orthogonal array design

水平因images/BZ_312_1864_1713_1895_1744.pngA酸醇物质的量比B每次微波加热时间/min C微波加热次数D超声时间/s 1 1.8∶1 3 3 75 2 2.0∶1 4 4 90 3 2.2∶1 5 5 105

1.3.3 最佳工艺条件验证

以正交试验所确定的最佳合成工艺条件对亚油酸和β-谷甾醇进行酯化反应合成亚油酸β-谷甾醇酯,验证比较酯化率的大小。

1.3.4 亚油酸β-谷甾醇酯的纯化

取正己烷80 mL,无水乙醇120 mL混匀,置于50 ℃水浴锅中加热至恒温,加入0.3 mol/L的KHCO3溶液至pH 7~8,溶解所制得的亚油酸β-谷甾醇酯粗品,并移入分液漏斗中静置分层,取上层清液,再重复萃取 一次[28]。将第2次萃取的上层清液于真空烘箱中烘干,得到纯化后的亚油酸β-谷甾醇酯,下一步对得到的亚油酸 β-谷甾醇酯进行分析鉴定,亚油酸与β-谷甾醇酯化反应方程式见图1。

图 1 酯化反应方程式
Fig. 1 Esterification reaction equation

1.3.5 反应产物的定性分析

1.3.5.1 HPLC分析检测条件[28]:色柱:C18反相色柱(4.6 mmh 250 mm,5 µm);流动相:丙酮-乙腈(3∶1,V/V);流速:0.8 mL/min;检测波长:210 nm;柱温:30 ℃;进量:10 µL。

1.3.5.2 FTIR分析

F TI R仪以衰减全反射技术(attenuate d tota l reflectance,ATR)测试β-谷甾醇以及亚油酸β-谷甾醇酯的特征结构。测试范围:4 000~525 cm1,分辨率为4 cm1;扫描次数为32 次;检测配件:ATR。

1.3.5.3 元分析

Vario EL cube元分析仪测试参数:燃烧管温度1 150 ℃,还原管温度850 ℃,吹扫时间10 s,N积分归零时间20 s,C积分归零时间10 s,H积分归零时间5 s,S积分归零时间25 s。

1.3.5.4 超导NMR分析

以氘代氯仿为溶剂,用超导核磁共振波仪对待测产物进行核磁共振1H分析。

1.3.6 酯化率计[29]

酯化率计见式(1):式中:W1为酯化反应前体系中的甾醇含量;W2为酯化反应后体系中的甾醇含量。

1.3.7 油溶性

取4 份50 mL的茶籽油水浴加热至80 ℃,边搅拌边加入亚油酸β-谷甾醇酯至饱和,然后分别置于5、4、25、40 ℃条件12 h,然后取茶籽油皂化洗涤处理[28],HPLC检测。亚油酸β-谷甾醇酯的油溶度计见式(2):

式中:M为茶籽油总质量;M1为总亚油酸β-谷甾醇酯的质量;M0为油空白亚油酸β-谷甾醇酯的质量。同理,计β-谷甾醇的油溶度。

1.4 数据处理

所有数据均采用Origin 8.0软件作图,每组数据重复3 次采,数据以f s表示,采用独立本t检验,用SPSS 17.0分析两组数据之间的差异,P<0.05, 差异显著。

2 结果与分析

2.1 单因试验结果

2.1.1 酸醇物质的量比对酯化率的影响

从图2可以看出,酯化率随着酸醇物质的量比的增大先减小后增大,酸醇物质的量比等于1∶1时酯化率最低为52.31%。当酸醇物质的量比小于1∶1时,即逐渐增加体系中β-谷甾醇的浓度,亚油酸的转化率增大;当酸醇物质的量比大于1∶1时,即逐渐增加体系中亚油酸的浓度, β-谷甾醇的转化率增大,酯化反应程度随着酸醇物质的量比的增加而增加[30],平衡向减少反应物的方向移动,即正向移动,符合勒夏特列原理[31]。当酸醇物质的量比达到2∶1时,酯化率已基本达到最高为78.82%,继续增加亚油酸的浓度,酯化率不再有明显的提高,可能是β-谷甾醇的转化率已达到最大,酸醇物质的量比2∶1为单因试验最优水平。

图 2 酯化率与酸醇物质的量比的关系
Fig. 2 relationship between esterification rate and molar ratio of acid to alcohol

2.1.2 微波加热时间对酯化率的影响

图 3 酯化率与微波加热时间的关系
Fig. 3 Relationship between esterification rate and microwave heating time

从图3可以看出,微波加热时间在1~4 min时,酯化率由10.06%增长到80.12%,酯化反应程度随着微波加热时间的延长而更加彻底,所以酯化率逐渐增高。当微波加热时间为4 min时,酯化反应达到平衡,酯化率基本达到最高,继续延长微波加热时间,酯化率不再提高反而有所下降,可能是因为随着微波加热时间延长酯化反应过程中生成了一些副反应物质[32],因微波加热时间 4 min为单因试验最优水平。

2.1.3 微波加热次数对酯化率的影响

从图4可以看出,随着微波加热次数的增加,酯化率逐渐提高,由微波加热1 次的34.11%增加到78.22%(加热4 次),微波加热次数的增加即是对整体加热时间的增加,在一定时间内酯化反应程度随着总体微波加热时间的延长而更加彻底,所以酯化率逐渐增高,体现了微波的热效应[33]。当微波加热次数为4 次时,酯化率已基本达到最高,继续增加加热次数,酯化率不再有明显的提高,证明当反应已基本达到平衡时微波并不能改变反应平衡常数[34],因微波加热次数4为单因试验最 优水平。

图4 酯化率与微波加热次数的关系
Fig. 4 Relationship between esterification rate and number of microwave heating cycles

2.1.4 超声时间对酯化率的影响

图 5 酯化率与超声时间的关系
Fig. 5 Relationship between esterification rate and ultrasonic irradiation time

从图5可以看出,没有超声波辅助时,合成亚油酸β-谷甾醇酯的酯化率仅为54.11%,引入超声波辅助(0~150 s)后,酯化率显著提高,超声90 s时酯化率达到76.18%证明超声波酯化反应具有较明显的促进作用。产生这一现象的原因是自然状况下β-谷甾醇粉末与亚油酸在反应体系中分为明显的两相,而酯交换反应只能在两相界面发生,亚油酸较为黏稠,有很大的传质阻力,超声波具有强大的传质和乳化作用,可以降低反应的活化能[35],并且可以促进羟自由基和甲氧基的产生,从而强化酯交换反应进程[36-37]。当超声时间为120 s时,酯化率为75.24%,有稍许降低,其原因可能是经过较长时间的间断加热,超声产生的热效应[38]小于反应体系降低的热量,等于间接短时间降低了反应温度,导致酯化率稍有下降。而在超声时间为150 s时,超声产生的热效应在一定程度上弥补了反应体系降低的热量,因酯化率又有所回升达到76.22%。整体来看,当超声90 s时,酯化率基本达到最高,继续增加超声时间,酯化率不再有明显提高,因超声时间90 s为单因试验最优水平。

2.2 正交试验结果

根据单因试验结果,以酯化率为考察指标,选择适当的酸醇物质的量比、每次微波加热时间、微波加热次数、超声时间,每个因设置3 个水平,进行L9(34)正交试验,结果见表2。

表 2 L9(34)正交试验设计及结果
Table 2 L9(34) orthogonal array design with experimental results

试验号 A酸醇物质的量比B每次微波加热时间/min C微波加热次数D超声时间/s 酯化率/%1 1.8∶1 3 3 75 55.68f 1.20 2 1.8∶1 4 4 90 68.32f 1.03 3 1.8∶1 5 5 105 69.67f 0.98 4 2∶1 3 4 105 68.44f 1.08 5 2∶1 4 5 75 71.73f 1.23 6 2∶1 5 3 90 79.79f 0.85 7 2.2∶1 3 5 90 59.12f 0.57 8 2.2∶1 4 3 105 79.52f 1.00 9 2.2∶1 5 4 75 83.43f 0.76 K1 193.67 183.24 214.99 210.84 K2 219.96 219.57 220.19 227.90 K3 222.07 232.89 200.52 217.63 k1 64.56 61.08 71.66 70.28 k2 73.32 73.19 73.40 75.97 k3 74.02 77.63 66.84 72.54 R 9.46 16.55 6.56 5.69

从表2可知,RB>RA>RC>RD,所以影响反应因的主次为B>A>C>D,即每次微波加热时间>酸醇物质的量比>微波加热次数>超声时间。最佳工艺组合为:A3B3C2D2,即酸醇物质的量比2.2∶1、每次微波加热时间5 min、微波加热4 次、每次超声90 s。

2.3 最佳工艺条件验证

按照正交试验得到的最佳合成工艺条件,即酸醇物质的量比为2.2∶1,每次微波加热时间5 min,微波加热4 次,每次超声90 s 进行酯化反应,平行做3 次实验,酯化率为(89.56f 1.24)%,高于正交试验中各试验结果,表明该最佳合成工艺条件能提高亚油酸β-谷甾醇酯的酯化率。

2.4 反应产物的定性分析

2.4.1 HPLC分析

图 6 β-谷甾醇HPLC图
Fig. 6 HPLC profile of β-sitosterol

图 7 亚油酸β-谷甾醇酯HPLC图
Fig. 7 HPLC profile of linoleyl β-sitosterol

图6 为β-谷甾醇的HPLC图,保留时间为14.397 min,图7为分离纯化后的亚油酸与β-谷甾醇反应产物的HPLC图,其中有且只有一个,且其保留时间为26.098 min,证明非β-谷甾醇。在分离纯化过程中过量的饱和KHCO3溶液可以充分洗去产物中未反应完全的亚油 酸[28],又由于亚油酸β-谷甾醇酯的极性小于β-谷甾醇,在反向色中极性强的组分先流出,且与亚油酸β-谷甾醇酯高纯品的出时间一致,所以保留时间为26.098 min的可能为高纯度的亚油酸β-谷甾醇酯。

2.4.2 FTIR分析

图 8 β-谷甾醇FTIR谱图
Fig. 8 Infrared spectrum of β-sitosterol

图 9 亚油酸β-谷甾醇酯FTIR谱图
Fig. 9 Infrared spectrum of linoleyl β-sitosterol

如图8所示,β-谷甾醇红外图中显示,β-谷甾醇在3 230~3 550 cm1范围内有吸收,且形较宽,处符合β-谷甾醇的—OH特征。如图9所示,在1 725~1 750 cm1范围内有比较强烈的吸收,为酯键的官能团C=O的特征吸收,且在3 230~3 550 cm1范围内无吸收,即证明反应完全,产物中已没有游离的β-谷甾醇,亚油酸与β-谷甾醇反应生成了酯。

2.4.3 元分析

对产物进行元分析,分别测定C元和H元的分子质量,取产物的检测值与亚油酸β-谷甾醇酯的理论值进行比较,结果见表3,发现两者误差均小于0.5%,证明合成的产物是所求证化合物。

表 3 元素分析结果
Table 3 Results of element analysis%

images/BZ_315_1498_899_1529_930.png品 C元images/BZ_315_1819_899_1850_930.png分子质量 H元images/BZ_315_2116_899_2147_930.png分子质量亚油酸β-谷甾醇酯理论值 83.37 11.91亚油酸β-谷甾醇酯检测值 83.64 11.68误差值 0.27 0.23

2.4.4 NMR鉴定结果'

图 10 亚油酸β-谷甾醇酯结构图
Fig. 10 Structure of linoleyl β-sitosterol

图 11 β-谷甾醇的1H-NMR
Fig. 11 1H-NMR profile of β-sitosterol

图 12 亚油酸β-谷甾醇酯的1H-NMR
Fig. 12 1H-NMR profile of linoleyl β-sitosterol

亚油酸β-谷甾醇酯的结构图见图10,β-谷甾醇和亚油酸β-谷甾醇酯的核磁图分别见图11和图12,经过分析两者C2、C3、C4和C9位置上的质子化学位移(表4),发现β-谷甾醇在这些位置上的化学位移均小于亚油酸β-谷甾醇酯相应位置上的质子化学位移,这是因为氢原子的电负性小于酯基的电负性。酯基的存在对质子产生诱导效应,酯基附近的H电子云密度降低,屏蔽效应减弱,质子靠近低场出,化学位移增大。

表 4 几种不同环境的质子化学位移
Table 4 Chemical shifts of protons in β-sitosterol and linoleyl β-sitosterol in different environments

位置 δ β-谷甾醇 亚油酸β-谷甾醇酯C2 1.01 1.83 C3 3.52 4.62 C4 2.28 2.36 C9 1.01 1.49

经积分得出β-谷甾醇的C2C9、C3、C4上的质子质量比是2.99∶1∶1.98,约为3∶1∶2,C2和C9上的质子化学位移相同,经推测C2和C9质量比为2∶1,符合β-谷甾醇的结构式。亚油酸β-谷甾醇酯中C2和C9上的质子化学位移不同,是由于酯基对C2上的质子有更强的诱导效应,且其C2、C3、C4、C9上的质子质量比是2.02∶1.00∶2.02∶1.00,约为2∶1∶2∶1,符合亚油酸β-谷甾醇酯的结构式。

亚油酸β-谷甾醇酯的图解析:

δ=0.897(s,J=0.99,6H)、0.923(s,J=0.92,6H)、1.016(s,J=1.02,3H)、1.165(s,J=1.16,3H)、1.299(s,J=1.30,9H)、1.304(s,J=1.30,10H)、1.314(s, J=1.30,6H)、1.341(s,J=1.34,2H)、1.363(s,J=1.36,3H)、1.456(s,J=1.46,1H)、1.49(s,J=1.49,2H)、1.62(s,J=1.62,5H)、1.83(s,J=1.83,2H)、1.902(s,J=1.90,1H)、1.943(s,J=1.95,2H)、1.994(s,J=1.99,1H)、2.015(d,J=2.01,2H)、2.064(d, J=2.04,4H)、2.36(m,2H)、2.400(m,2H)、2.768 (t,J=2.77,2H)、4.62(s,J=4.62,1H)、5.304(s,J=5.33,1H)、5.334(d,J=5.37,2H)、5.403(s,J=5.39,2H)。

2.5 HPLC定量分析

将0.02、0.08、0.16、0.24、0.28、0.32 mg/mL的高纯亚油酸β-谷甾醇酯溶液依次进,测定方法参考1.3.5.1节。分别以亚油酸β-谷甾醇酯溶液的面积和浓度作为横纵坐标绘制标准曲线,计得出标准曲线的回归方程为y=1 428x36.58,R2=0.999 6。最后测得合成的亚油酸β-谷甾醇酯经过分离纯化后的纯度为98.36%。2.6 油溶性分析

β-谷甾醇和亚油酸β-谷甾醇酯在5、4、25、40 ℃于茶籽油中的溶解度分别为(0.54f 0.02)%、(0.72f 0.04)%、(1.33f 0.08)%、(1.49f 0.06)%和(24.47f 0.82)%、(27.02f 0.71)%、(33.68f 0.60)%、(36.92f 1.04)%,如图13所示。β-谷甾醇和亚油酸β-谷甾醇酯在茶籽油中的溶解度均随温度的升高而增大,亚油酸β-谷甾醇酯在不同温度下于茶籽油中的溶解度是 β-谷甾醇的25~45 倍,且与β-谷甾醇相比在茶籽油中的溶解度在不同温度下(5、4、25、40 ℃)均呈显著性差异(P<0.05)。

图 13 β-谷甾醇和亚油酸β-谷甾醇酯的溶解度
Fig. 13 Solubilities of β-sitosterol and linoleyl β-sitosterol

*.差异显著(P<0.05)。

3 结 论

本研究优化亚油酸β-谷甾醇酯的最佳合成条件为酸醇物质的量比2.2∶1、每次微波加热时间5 min、微波加热4 次、每次超声90 s,酯化率为89.56%。所得产物经过分离纯化后,用HPLC分析知产物中无未反应完的β-谷甾醇,经过FTIR分析知反应中生成了酯,经过元分析知产物与所求证化合物及其吻合,经过NMR分析产物确证为亚油酸β-谷甾醇酯。最后,经过HPLC测定产物纯度为98.36%,在茶籽油(25 ℃)中的溶解度为33.68%,相比于β-谷甾醇(1.33%)提高了25 倍,可以更广泛的应用于食品、化妆品、保健品领域。至于亚油酸β-谷甾醇酯的具体的生物活性以及亚油酸和β-谷甾醇合成的亚油酸 β-谷甾醇酯在降血脂方面能否产生协同效应可以进行更加深入的研究。本合成工艺简单,耗时短,不使用额外的催化剂,为合成甾醇酯类产品开辟了更加绿色、经济、简洁、高效的途径。

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Ultrasound and Microwave-Assisted Synthesis of Linoleyl β-Sitosterol

YUAN Chuanxun, ZHANG Xueru, XU Yun, GUO Yuhua, JIN Risheng*
(Engineering Research Center of Bioprocess, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract: Linoleyl β-sitosterol was synthesized by sequential microwave and ultrasonic treatment. Qualitative and quantitative analysis of the synthetic product was carried out. Single factor and orthogonal array design experiments were conducted to examine the effect of molar ratio of acid to alcohol, microwave heating time, number of microwave heating cycles and ultrasound irradiation time on the esterification rate in order to optimize the four conditions. The synthetic product was purified by solvent extraction and was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), infrared spectroscopy, an element analyzer and nuclear magnetic resonance (NMR), and its oil solubility was studied. The results showed that the optimum conditions were as follows: molar ratio of acid to alcohol 2.2:1, microwave heating time 5 min, and 4 microwave heating cycles with 90 s ultrasonic irradiation apart, giving an esterification rate of up to 89.56%. The synthesized substance was identified as linoleyl β-sitosterol with a purity of up to 98.36%. The solubility of the linoleyl β-sitosterol in tea seed oil at different temperatures (-5, 4, 25 and 40 ℃) was more than 25 times higher than that of β-sitosterol under the same conditions.

Keywords: β-sitosterol; linoleic acid; ultrasound; microwave; esterification DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181227-304

中图分类号:TS224

文献标志码:A

文章编号:1002-6630(2020)02-0291-07

引文格式:袁传勋, 张雪茹, 徐云, 等. 超声-微波法合成亚油酸β-谷甾醇酯[J]. 食品科学, 2020, 41(2): 291-297. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181227-304. http://www.spkx.net.cn

YUAN Chuanxun, ZHANG Xueru, XU Yun, et al. Ultrasound and microwave-assisted synthesis of linoleyl β-sitosterol[J]. Food Science, 2020, 41(2): 291-297. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20181227-304. http://www.spkx.net.cn