氟虫腈是一种广谱性苯基吡唑类杀虫剂，由原法国罗纳-普朗克公司于1987年开发，并于1993年进入中国[1]，由于其对有机磷、有机氯、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯类农药具有抗性的昆虫具有很高的敏感性，且与现有的农药无交叉抗性，被广泛用于农业和城市病虫害防治中。氟虫腈可通过氧化、还原和水解过程降解，产生代谢产物氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜。研究表明，氟虫腈代谢产物在人体中的保留时间比氟虫腈母体更长，生物蓄积性更强，内分泌破坏力更高[2-5]。
禽类养殖的过程中，养殖户为了防止跳蚤、螨虫、虱子等寄生虫引起动物患病，会违规使用氟虫腈作为杀虫剂用于养殖场的消毒清洁。但使用的氟虫腈会残留于饲料、环境水源及泥土中，之后又随之被禽类动物吸收进入体内，造成氟虫腈及其代谢物在禽类体内不断蓄积，形成氟虫腈及其代谢物残留[6]。欧盟等国家和地区对于禽类食品中氟虫腈及其代谢物设定了严格的最大限量，其中欧盟规定氟虫腈和氟虫腈砜总计的最大残留限量值仅为0.005 mg/kg[7]；国际食品法典委员会规定禽蛋中氟虫腈的最大残留限量值为0.02 mg/kg，禽肉中则为0.01 mg/kg[8]。GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》规定禽肉类最大残留限量0.01 mg/kg；禽蛋及禽类内脏则为0.02 mg/kg[9]。为保障禽类产品安全，需建立一种快速、灵敏、准确的氟虫腈残留量检测方法，为建立禽类产品风险评估分析提供可靠技术支持。
目前，食品中氟虫腈及其代谢物的测定方法主要有气相色谱法[10-11]、气相色谱-质谱联用法[12-14]、液相色谱-质谱联用法[15-17]，这些方法中常用的前处理方法有液-液萃取[18]、固相萃取[19]、固相微萃取[10]、QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）[13,20-21]。
QuEChERS技术因高效、快速、成本低等特点，被广泛地应用于农兽药残留检测领域[22]。QuEChERS前处理常用试剂净化材料主要是十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、N-丙基乙二胺吸附剂（primary secondary amine，PSA），可满足大部分食品中农兽药残留的检测，但是对于脂肪、磷脂、蛋白含量较高的动物性食品，经QuEChERS前处理后，仍会出现较大的基质干扰，影响灵敏度和测准确度。宁霄等[20]采用传统QuEChERS前处理技术应用于动物源性食品中氟虫腈及其代谢物残留检测，结果显示该方法基质效应在0.873～1.461之间，特别是在鸡肉和鸡肝中呈明显的基质增强效应，检测灵敏度为5 μg/kg，平均加标回收率在75.7%～104.5%之间，相对标准偏差在1.3%～10.4%之间；郝杰等[23]建立基于QuEChERS前处理技术的鸡蛋、鸡肉中氟虫腈及其代谢物残留检测方法，结果显示该方法的基质效应在-16.9～9.66之间，说明该QuEChERS方法存在很强的基质效应，方法定量限为1 μg/kg；罗亮[24]研究了3 种食品中氟虫腈及其代谢物残留检测方法，样品经QuEChERS方法提取后，经气相色谱-质谱检测，该方法检出限为4.5 μg/kg，回收率在72.1%～112.4%之间，相对标准偏差均小于7.0%。
综上所述，目前用于检测动物性食品中氟虫腈的QuEChERS前处理方法存在基质效应大，检测灵敏度及准确度较低的问题，针对上述问题本研究将新型材料多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）和碳十八键合锆胶（Z-Sep+）应用于禽类食品中氟虫腈及其代谢物QuEChERS前处理方法中，二氧化锆是唯一同时具有表面酸性位和碱性位的过渡金属氧化物，具有路易斯酸⁃碱的特性，氧化锆包覆硅胶和Z-SEP+是新型固相吸附剂，它对脂类化合物如甘油酯和磷脂、色素具有很强的吸附力[25]；MWCNT是由几层到几十层石墨烯片同轴卷曲而成的无缝管状物，其π-π作用、疏水作用、大的比表面积及其中空结构使其能够有选择、可逆地吸附某些化合物，特别是对亲脂分子有很强的吸附力[26-27]。
本研究先通过Plackett-Burman试验筛选出QuEChERS前处理中显著影响化合物回收率的因素，再用响应面法优化显著影响的用量，建立改良QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱测定禽类食品中的氟虫腈及代谢物的方法，经方法学验证，该方法可用于禽类产品中氟虫腈及其代谢物残留的快速定量测定。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
鸡蛋、鸡肉、鸡肝 市购。
氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈 农业部环境保护科研监测所；乙腈（色谱纯） 美国ACS恩科化学；NaCl、无水MgSO4（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂有限公司；C18、PSA 天津博纳艾杰尔科技有限公司；Z-Sep+ 美国Supelco公司；MWCNT南京先丰纳米科技公司。
1.2 仪器与设备
LCMS-8040高效液相色谱-三重四极杆串联质谱联用仪（配电喷雾离子源及LCMS solution3.2）、AUW220型电子分析天平 日本岛津企业管理有限公司；ST16R高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher公司；UC-7100S型数控超声波清洗器 美瑞泰克科技有限公司；S25旋涡混匀器 德国IKA公司；Milli Q超纯水系统 美国Millipore公司。
1.3 方法
1.3.1 液相色谱条件
色谱柱：Shim-pack XR-ODS（2.0 mm×75 mm，1.7 µm）；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；流动相：A 为乙腈，B 为水；梯度洗脱条件：0 ～0.5 m i n，50%～70% A，50%～30% B；0.5～3.0 min，70% A，30% B；3.0～3.5 min，70%～99% A，30%～1% B；3.5～4.5 min，99% A，1% B；4.5～5.0 m in，99%～50% A，1%～50% B；5.0～6.0 min，50% A，50% B；进样量10 μL。
1.3.2 质谱条件
电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测扫描模式；离子喷雾电压4.5 kV；雾化气为氮气，流速3.0 L/min；干燥气为氮气，流速15 L/min；碰撞气为氩气；脱溶剂管温度250 ℃；加热模块温度400 ℃。氟虫腈及其代谢物的检测参数见表1。
表1 氟虫腈及其代谢产物质谱参数
Table 1 MS parameters for detection of fipronil and its metabolites
images/BZ_337_224_1234_1202_1316.png氟虫腈 3.183 435.00 330.10 -24 -15 -30 250.05 -15 -43 -25氟甲腈 3.252 387.10 351.10 -10 -21 -24 282.10 -13 -16 -14氟虫腈砜 3.347 451.00 415.10 -21 -10 -18 282.10 -14 -23 -23氟虫腈亚砜 3.367 419.00 262.05 -18 -16 -17 383.10 -12 -23 -23
1.3.3 标准溶液的配制
分别准确吸取质量浓度为100 μg/mL氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜、氟虫腈砜标准溶液各1 mL，用乙腈稀释至100 mL，摇匀，制成1 μg/mL的混合标准中间液，-20 ℃保存，保存期1 个月。
1.3.4 样品前处理
准确称取5 g经充分均质的样品于50 mL离心管中，加入5 mL水，涡旋混匀30 s，加入25 mL乙腈，混匀，超声提取5 min，随后加入盐包（含4 g无水MgSO4及1 g NaCl），涡旋混匀1 min，4 ℃、10 000 r/min离心5 min。准确取1 mL上清液至2 mL净化管（含50 mg Z-Sep+、13 mg MWCNT、150 mg无水MgSO4），涡旋混合30 s，5 000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm微孔过滤后，待测。
1.3.5 Plackett-Burman试验与单因素试验
采用Plackett-Burman试验（n=20），对QuEChERS前处理方法中乙腈提取体积、超声时间、无水MgSO4质量、NaCl质量、净化体积、C18质量、Z-Sep+质量、MWCNT质量8 个因素进行考察，试验设计如表2所示，响应值为3 次平行试验氟虫腈及其代谢物回收率的平均值。
根据Plackett-Burman试验结果，对筛选出的显著影响因素：乙腈体积、Z-Sep+质量、MWCNT质量进行单因素试验，以缩小后续响应面试验优化范围。
表2Plackett-Burman试验设计因素与水平
Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Plackett-Burman design
images/BZ_337_1299_518_2278_613.pngA乙腈体积/mL 15 25 B超声时间/min 5 10 C无水MgSO4质量/g 4 6 D NaCl质量/g 1 2 E净化体积/mL 1 2 F Z-Sep+质量/mg 0 100 G C18质量/mg 0 100 H MWCNT质量/mg 0 20
1.3.6 Box-Behnken响应面试验设计
在单因素试验基础上，确定待优化因素大致的最佳范围，对其进行Box-Behnken响应面试验设计，每个因素进行3 个不同水平的试验，因素与水平设计如表3所示。
表3Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 3 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design
images/BZ_337_1299_1531_2275_1625.pngA乙腈体积/mL 15 20 25 B Z-Sep+质量/mg 50 75 100 C MWCNT质量/mg 5 10 15
1.3.7 基质效应评估与方法学验证
基质是指样品中除目标物之外的其他成分，会对目标物的分析过程造成干扰，并影响结果的准确性，这些影响即称之为基质效应。本实验通过空白加入法考察基质效应，取鸡蛋、鸡肝、鸡肉3 种样品按照1.3.4节前处理，得到的空白基质溶液分别配制3 条基质标准曲线，将所得曲线的斜率按下式计算得到绝对基质效应：
式中：Sm为基质配制的校准曲线斜率；Ss为纯溶剂配制的校准曲线斜率。若基质效应小于100%，则存在基质抑制效应，若基质效应大于100%，则存在基质增强效应。
2 结果与分析
2.1 质谱参数优化
由于氟虫腈及其代谢物结构中含有较多电负性强的基团——卤代原子，在强吸电基团作用下分子易去质子化，形成负离子。选择负离子模式，依次将氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜的标准溶液（0.5 μg/mL）直接注入质谱中，进行一级质谱扫描，4 种化合物容易去质子化形成m/z分别为435.00、387.10、451.00和419.00的[M-H]-离子，将这些分子离子峰选作前体离子进行二级质谱扫描，得到二级质谱信息，选取响应强度高、干扰小的两对离子作为定量离子和定性离子，优化的质谱参数如表1所示。
2.2 Plackett-Burman试验结果
通过Plackett-Burman设计可对试验中大部分因素进行初步筛选，从而可用较少的实验次数，从众多因素中快速筛选显著影响实验结果的因素[28]。本研究考察乙腈体积、超声时间、无水MgSO4质量、NaCl质量、净化体积、C18质量、Z-Sep+质量、MWCNT质量8 个因素在QuEChERS前处理方法中的作用，将回收率作为响应值。运用Minitab 18软件对所得数据进行分析，结果用标准化帕累托图表示，从图1可以看出，4 种化合物均有3 个因素的标准化效应值超过了基准参照线（图中虚线），分别为Z-Sep+质量、MWCNT质量、乙腈体积，表明这3 个因素对回收率影响显著。从图1a、b、d可看出，影响氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜回收率因素显著性为Z-Sep+质量＞MWCNT质量＞乙腈体积；从图1c可看出，影响氟虫腈砜回收率因素显著性为Z-Sep+质量＞乙腈体积＞MWCNT质量。此外，实验结果中发现与未使用Z-Sep+处理组相比，Z-Sep+处理组色谱图更干净，信噪比值更大；与未使用MWCNT处理组相比，使用MWCNT净化后的提取液颜色更浅，净化效果明显。在后续试验中这3 种因素作为主要因素进一步优化。
图1 试验因素标准化效应帕累托图
Fig. 1 Pareto charts of the standardized effects
2.3 单因素试验结果
图2 各因素对回收率的影响
Fig. 2 Effect of the three selected variables on the recovery of analytes
根据Plackett-Burman试验结果，选择乙腈体积、MWCNT质量、Z-Sep+质量3 个因素进行单因素试验优化，每个因素设置5 个水平，确定其最佳值所处范围供响应面法参考，结果如图2所示。由图2a可知，随乙腈体积的增加，回收率呈上升趋势，但乙腈体积超过25 mL时，回收率超过100%，故选择乙腈体积20 mL；图2b显示，Z-Sep+质量为0～75 mg时，回收率上升，超过75 mg，4 种分析物回收率均有所下降，故Z-Sep+质量为75 mg；由图2c可知，当MWCNT质量为10 mg时，4 种分析物的回收率最高，超过10 mg，回收率呈现下降趋势，MWCNT质量选为10 mg。
2.4 Box-Behnken响应面试验结果
在Plackett-Burman及单因素试验结果的基础上，选择乙腈体积、MWCNT质量和Z-Sep+质量进行3因素3水平的Box-Behnken响应面优化试验，应用Minitab 18软件对数据进行回归拟合分析，建立二次响应模型，得到的4 种化合物回收率对自变量A、B、C的多元二次回归模型，拟合回归方程如下：
氟虫腈拟合方程：R=121.4+1.86A-0.58B-0.74C-0.12A2-0.006 1B2+0.052C2+0.058AB-0.076AC+0.022BC。
氟甲腈拟合方程：R=175.4-3.81A-0.31B-1.85C-0.01B2+0.063AB+0.049BC。
氟虫腈砜拟合方程：R=194.4-5.61A-0.46B-3.749C+0.076A2-0.006 9B2+0.13C2+0.052AB+0.033BC。
氟虫腈亚砜拟合方程：R=141.6-1.80A-0.2B-2.315C-0.009 2B2+0.046AB-0.11AC+0.05BC。
为检测二次回归模型的有效性，对回归方程进行方差分析和显著性检测，结果如表4所示，4 种模型的P值均小于0.01，说明该回归模型影响极显著，3 个自变量乙腈提取体积（A）、Z-Sep+（B）、MWCNT（C）在4 种模型中的P值均小于0.01，说明以上变量对回收率影响极显著，在相应的置信水平下，拟合模型的F值超过ANOVA表中F值的1.5 倍，表明该模型影响显著[29]。4 种分析物的模型F值均大于1.5 倍F0.95（F0.95=3.63），且回归系数R2和调整回归系数
值高（氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜模型对应R2分别为0.993 6、0.975 4、0.982 6、0.985 7，
分别为0.982 2、0.931 1、0.951 4、0.959 9）表明因变量和3 个自变量之间的多元回归关系很显著，拟合度好，可用于分析和预测各因素对4 种分析物回收率的影响。
表4 二次模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model
注：P＜0.01，差异极显著；P＜0.05，差异显著。
images/BZ_339_224_2496_1205_2591.png模型 9 86.91 ＜0.001 22.01 0.002 31.42 0.001 38.2 ＜0.001 A乙腈体积 1 413.9 ＜0.001 77 ＜0.001 137.72 ＜0.001 137.57 ＜0.001 B Z-Sep+质量 1 136.62 ＜0.001 58.03 0.001 57.54 0.001 88.08 ＜0.001 C MWCNT 1 99.02 ＜0.001 44.92 0.001 24.38 0.004 41.96 0.001 A2 1 52.02 0.001 ＜0.001 0.958 6.93 0.046 0.09 0.774 B2 1 81.53 ＜0.001 46.74 0.001 35.75 0.002 55.58 0.001 C2 1 9.34 0.028 0.19 0.68 19.91 0.007 0.96 0.372 AB 1 319.02 ＜0.001 77 ＜0.001 87.95 ＜0.001 60.85 0.001 AC 1 21.44 0.006 3.04 0.141 5.64 0.064 13.13 0.015 BC 1 45.56 0.001 46.8 0.001 35.8 0.002 72.06 ＜0.001失拟项 3 0.31 0.822 0.58 0.682 0.27 0.844 0.53 0.705
根据拟合的回归方程式进行响应面分析，并绘制变量之间相互作用的响应面图，结果如图3所示。响应面的斜率越大，表明该因素对结果的影响更大[30]。图3a1可看出，氟虫腈回收率随着乙腈体积的增加而下降，随着Z-Sep+质量先增加后降低；图3a2可以看出，回收率随乙腈体积或MWCNT质量的增加而增加，从曲线斜率看乙腈体积对回收率的影响更大；图3a3可以看出，从曲面斜率看，BC交互影响因素比AC显著。分析各交互因素对氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜对回收率的影响，分析结果与氟虫腈结果相似。
通过Minitab 18软件响应优化器，当4 种化合物回收率目标为100%时，确定最佳QuEChERS条件为乙腈体积25 mL、Z-Sep+质量50 mg和MWCNT质量13 mg，该最优条件下氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜的回收率预测值分别为108.3%、103.2%、100.0%、100.0%。采用优化后的参数进行验证实验，经6 次平行实验后测得平均回收率分别为98.8%、98.5%、97.7%、102.2%，除氟虫腈差异较大，其余3 种化合物与模型预测值差异不明显；说明拟合模型优化出的QuEChERS条件较为准确。
图3 各因素交互作用对回收率影响的响应面图
Fig. 3 Response surface plots showing the interactive effects of the selected variables on the recovery of analytes
2.5 基质效应
表5 氟虫腈及其代谢物基质效应、检出限、定量限
Table 5 Matrix effects, LODs and LOQs for fipronil and its metabolites
名称 基质 回归方程 相关系数r基质效应/%检出限/（μg/kg）定量限/（μg/kg）氟虫腈乙腈 y=39 683x+7 139.3 0.999 6鸡肝 y=32 701x-5 548.5 0.999 9 82.4 0.2 0.5鸡蛋 y=36 304x+3 959.5 0.999 6 91.5 0.1 0.5鸡肉 y=39 291x+4 922.3 0.999 5 99.0 0.1 0.5氟甲腈乙腈 y=75 380x+11 505 0.999 6鸡肝 y=62 107x+1 102.6 0.999 8 82.4 0.2 0.5鸡蛋 y=71 871x+9 755.1 0.999 5 95.3 0.1 0.5鸡肉 y=75 332x+11 375 0.999 6 99.9 0.1 0.5氟虫腈砜乙腈 y=50 283x-1 163.1 0.999 9鸡肝 y=42 465x+14 600 0.999 9 84.5 0.2 0.5鸡蛋 y=49 496x+4 569.7 0.999 7 98.4 0.1 0.5鸡肉 y=48 120x+8 318.3 0.999 6 95.7 0.1 0.5氟虫腈亚砜乙腈 y=55 685x+12 366 0.999 6鸡肝 y=48 532x+3 087.1 0.999 5 87.2 0.2 0.5鸡蛋 y=58 257x+5 504.5 0.999 7 104.6 0.1 0.5鸡肉 y=58 555x+9 085.5 0.999 6 105.2 0.1 0.5
考察氟虫腈及其代谢物在鸡肝、鸡肉、鸡蛋3 种食品中的基质效应，结果见表5。从不同样品基质看，鸡肝的基质效应最大，4 种化合物的基质效应在82.3%～87.25%之间，呈基质抑制效应，其次为鸡蛋，鸡肉中基质效应最小，基本不存在干扰，与宁霄[20]、郝杰[23]等研究相比，基质效应大大降低。从检测对象看，氟虫腈的基质效应最大，呈基质抑制效应，其次为氟甲腈，其余2 种基质效应不明显。为克服基质效应，本研究使用基质加标法进行定量测定。
2.6 方法学验证
2.6.1 方法的线性、检出限、定量限结果
添加不同质量浓度混合标准溶液至空白样品进行测试，以目标峰RSN=3时确定为检出限，RSN=10为定量限，3 种样品基质中4 种化合物的具体结果见表5。在0.1～5 μg/L质量浓度范围内，氟虫腈及其代谢物的线性关系良好，线性相关系数均大于0.999，检出限为0.1～0.2 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg，低于GB 2763—2019规定禽肉类最大残留限量0.01 mg/kg，禽蛋及禽类内脏则为0.02 mg/kg。
2.6.2 方法的回收率与精密度
选取鸡肉、鸡蛋、鸡肝3 种空白样品，不同添加量的混合标准溶液，使添加量达到0.5、2、25 μg/kg，每个添加水平平行6 次，计算各化合物的平均回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），由表6可知，4 种化合物在鸡蛋平均加标回收率在78.9%～113.5%之间，RSD在2.10%～7.60%之间，方法具有较好的回收率和重复性。证明此样品前处理方法及超高效液相色谱-串联质谱检测方法灵敏、准确、有效，适用于禽源性食品中氟虫腈及其代谢物残留的同时测定。
表6 鸡蛋、鸡肝、鸡肉基质中氟虫腈及其代谢物平均回收率和精密度（n= 6）
Table 6 Average recoveries and precision of fipronil and its metabolites from spiked egg, chicken liver, and chicken (n= 6)
images/BZ_341_224_2266_1202_2360.png鸡蛋0.5 80.1 2.77 89.3 2.61 99.7 2.17 93.4 4.38 2 94.0 7.60 89.3 2.46 85.9 5.06 104.4 2.91 25 113.3 3.47 91.7 2.55 111.3 5.41 109.0 3.23鸡肝0.5 80.9 2.10 94.2 2.82 104.2 2.31 97.3 3.19 2 108.5 6.54 89.2 5.32 87.6 6.22 113.5 4.30 25 107.0 3.88 112.3 4.42 101.3 5.81 95.8 4.20鸡肉0.5 78.9 4.21 91.3 4.24 104.5 3.72 98.7 3.01 2 95.3 4.75 87.7 4.79 95.5 5.43 83.5 5.43 25 89.8 7.33 90.8 5.67 96.2 6.66 104.7 4.47
2.6.3 实际样品分析结果
随机购买市售鸡肝、鸡肉、鸡蛋共20 份样品，应用本方法测定氟虫腈及其代谢物残留，样品中均未检出氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈亚砜残留，有一份鸡蛋中检出氟虫腈砜0.81 μg/kg，未超过GB 2763—2019中所规定氟虫腈在鸡蛋中的最大残留限量20 μg/kg。阳性样品提取离子色谱图如图4所示。
图4 阳性样品的氟虫腈（a）、氟甲腈（b）、氟虫腈砜（c）和氟虫腈亚砜（d）的定量离子提取离子流图
Fig. 4 Extracted ion chromatograms of fipronil (a), fipronil desulfinyl (b),fipronil sulfone (c) and fipronil sulfide (d) in positive samples
3 结 论
本研究将QuEChERS新型净化材料Z-Sep+、MWCNT用于禽源性食品样品前处理，通过Plackett-Burman试验和响应面Box-Behnken方法确定最佳前处理条件，建立超高效液相色谱-串联质谱测定禽源性食品中氟虫腈及其代谢物残留的分析方法。本方法前处理速度快，无需复杂净化手段，基质效应小，经方法学验证，该方法的回收率、精密度、线性、定量限、检出限等均满足痕量残留检测的要求，可用于禽源性食品中氟虫腈及其代谢物残留的快速定量测定。
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