VK主要包括2-甲基-3-植基-1,4-萘醌又名叶绿醌（phylloquinone，PK）、甲基萘醌（menaquinone-n，MK-n）和甲萘醌（menadione，MD）[1-2]，PK和MK是VK的天然形式，而MD是一种用作药物的化学合成衍生物，但也有文献报道通过饮食摄入后，肠道细菌可以将PK分解为MD的现象[3]。VK不仅与凝血功能有关，而且与骨代谢有关，还被用于治疗恶性肿瘤、支气管哮喘等疾病，近年研究发现，VK缺乏的共同危险因素还包括膳食摄入量不足、吸收不良综合征（尤其是胆汁淤积性肝疾病）、抗生素治疗和肾功能不全等[4]。食物中最常见的VK是PK，它可由所有植物和绿藻产生，蔬菜的绿色强度一般也与PK含量有关[5]。虽然PK普遍存在于各种食物中，但PK的主要食物来源还是绿叶蔬菜和植物油。MK合成由肠道菌群中的细菌完成，其作用是细菌呼吸运输链中的电子载体[1]，所以MK主要存在于肉类、乳制品和发酵食品，如奶酪中，以四烯甲萘醌（menatetrenone 4，MK-4）、七烯甲萘醌（menatetrenone 7，MK-7）最具代表性[5]。
目前，食品中VK的检测方法主要有毛细管电泳法[6]、液相色谱-串联紫外检测法[5,7-8]或荧光检测法（需要衍生化步骤）[9-11]、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法，离子源分为大气电压离子源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）[12-14]和电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）[15-18]，离子模式均为正离子模式。VK分析测定的食物基质主要为果蔬[5,12,14,16-17,19-20]、植物油[21-22]、奶制品和婴幼儿配方奶粉[13,15,23-25]。因VK不稳定，所以提取VK的前处理需避免影响稳定性的因素，如紫外线、碱性和酸性介质等。对于富含脂质基质的食品如牛奶等，还需增加水解步骤，确保脂质尽可能被皂化[13,25]或酶解消化去除[15]。食品中VK常见的萃取方法是利用正己烷从样品基质中分离维生素，再通过固相萃取（solid phase extraction，SPE）[5,26-27]、基质固相分散萃取（matrix solid phase dispersion，MSPD）[12]或加速溶剂萃取法[19]对提取物的VK进行纯化。样品处理量大，稳定性受到影响。
近年来出现的样品处理微型化技术可以实现被测物质在最小环境影响下的高浓缩，研究表明分散液液微萃取（dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME）[14]、固相微萃取[28]和浊点萃取（cloud point extraction，CPE）法[29]技术对维生素的预浓缩具有很好的效果，与传统常规萃取方法中用到有毒表面活性剂和易燃有机试剂相比，CPE法的预浓缩过程广泛应用非离子表面活性剂，是一种高效的绿色微萃取方法。考虑到CPE在预浓缩步骤中的优越性，本实验优化蔬菜中天然VK同系物的CPE提取方法，并以超声辅助提取，通过LC-ESI-MS/MS对蔬菜中的PK和MK-4进行定性、定量分析，旨在为食品中VK的检测、应用和监管提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
8 种蔬菜：卷心莴苣（生菜）、上海青、菊苣、羽衣甘蓝、菠菜、水芹菜、白萝卜（根茎）和胡萝卜（根茎）均为市购。
PK、MK-4标准品（纯度≥98%） 美国Sigma-Aldrich公司；非离子表面活性剂聚乙二醇4-叔辛基苯基醚（Triton X-45）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-114）、1-己基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐（[C6MIm]NTf2）、1-甲基-3-辛基双三氟甲磺酰亚胺盐（[C8MIm]NTf2）和1-十二烷基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐（[C12MIm]NTf2） 德国Merck公司；无水硫酸镁、氯化钠（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙醇、乙腈（均为色谱纯） 上海安谱实验科技股份有限公司；实验用水Milli-Q系统纯化水。
1.2 仪器与设备
TSQ Quantis LC-MS/MS联用仪（配有ESI） 美国Thermo公司；A11均质仪 德国IKA公司；UP200H手持式超声波处理器 德国Hielscher公司；EBA20/20S离心机 德国Hettich公司；M3-L205C家用微波炉 中国美的集团；Milli-Q超纯水器 美国Millipore公司。
1.3 方法
1.3.1 标准储备液和工作溶液的配制
分别精密称取2 种化合物各10.0 mg，用乙醇溶解并定容至50.00 mL。此标准溶液质量浓度为0.20 mg/mL，贮存于棕色玻璃瓶中，-20 ℃避光保存。作为标准储备液。精密吸取标准储备液适量，配制混合标准工作液，用乙醇稀释并定容，其中PK和MK的质量浓度为1.0 μg/mL，-20 ℃避光保存。用乙醇适当稀释1.0 μg/mL PK和MK的标准工作液配制不同质量浓度的校准标样，现配现用。
1.3.2 色谱条件
色谱柱：Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样量5.0 μL；流动相A：0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵溶液；流动相B：含0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵的甲醇溶液；洗脱程序：0～4.0 min，30%～90% A，70%～10% B；4.0～6.0 min，90% A，10% B；6.0～8.0 min，90%～30% A，10%～70% B；8.0～10 min，30% A，70% B。
1.3.3 质谱条件
ESI；多反应监测；喷雾电压3.0 kV；离子传输管温度325 ℃；雾化器温度350 ℃；鞘气（N2）压力40 psi；辅助气（N2）压力10 arb；碰撞气（Ar）流速2.5 L/h；循环时间0.5 s；Q1分辨率0.7，Q3分辨率0.7。在正离子监测模式下，分别对碰撞能量和选择离子等质谱参数进行优化，选取碰撞后所得丰度较高的2 个子离子作为特征离子。
1.3.4 样品前处理
新鲜蔬菜样品用蒸馏水洗涤数次并自然风干去除多余的水分。为防止VK的降解，需将样品保存在4 ℃弱光条件下，样品在到达实验室后48 h内进行分析。将所有样品手动切成长宽约0.5 cm的小块，使用电动均质器均质化。超声辅助提取分离蔬菜样品中的维生素，称取1.5 g样品至装有0.15 g氯化钠的15 mL玻璃离心管中，加入2 mL乙腈。混匀后用超声探头直接进行超声处理，探头以52.5%振幅、0.75 s脉冲处理1 min，6 000 r/min离心5 min。取1 mL乙腈上清液，加入5 mL含0.4 mg/mL氯化钠的10 mmol/L乙酸铵溶液（pH 7），加入50 μL的0.15 g/mL的Triton X-45，手动混匀30 s。将所得溶液置于水浴中，并在家用微波炉中以最大功率900 W加热20 s，得到浑浊溶液，VK提取到通过样品溶液分散的凝聚层细小液滴中；然后将试管浸入冰浴中5 min，以促进富表面活性剂相的分离，表面活性剂相沉淀在锥形管底部（液滴体积约15 μL），使用微注射器收集，将回收的液滴置于进样小瓶中，加入30 μL甲醇进行稀释，然后将其通过自动进样器注入LC-MS/MS系统。试样液经LC-MS/MS分析，根据保留时间和离子对定性，外标峰面积法定量。用乙醇配制50 ng/mL的PK和MK混合标准溶液作为阳性质控样品，-20 ℃条件下可稳定保存1 个月，预实验表明白萝卜中未检测到PK和MK，因此采用白萝卜作为空白基质样品用作阴性质控样品。采用4因素3水平设计对影响CPE萃取效率的不同变量进行优化，即表面活性剂体积、水相体积、氯化钠质量浓度和加热时间（表1）。取超声辅助提取后的1 mL乙腈提取液用于分析物的富集，并用5～9 mL范围内的不同水量进行稀释，表面活性剂添加体积在50～150 μL之间，氯化钠质量浓度范围在0.2～0.4 g/L之间，当将表面活性剂-萃取相混合物加热到相应的浊点温度以上（25～38 ℃之间，取决于质量浓度）时，会形成云层状浑浊溶液。使用水浴在10～20 min范围内研究不同加热时间的影响。所有处理均应将混合物以3 500 r/min离心3 min，然后在-20 ℃冰箱中冷冻5 min，以促进相的分离。
表1 CPE变量试验设计因素与水平
Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables studied in one-factor-at-a-time design for CPE
因素 水平1 2 3 Triton X-45体积/μL 50 100 150水相体积/mL 5 7.5 10氯化钠质量浓度/（g/L） 0.2 0.3 0.4加热时间/min 10 15 20
1.3.5 加标回收率实验
加标样品制备：称取1～1.5 g（精确至0.1 mg）均质后的2 种蔬菜样品（莴苣和萝卜），一份作为基质本底值测定，一份置于25 mL具塞棕色玻璃比色管中，加入适量混合标准溶液，分别添加40、80 ng/g和120 ng/g 3 个水平进行回收率实验，每个添加量进行6 次平行实验，同时做空白实验，均扣除本底值后计算加标回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。室温放置1 h，待样品完全吸收标准溶液后，按上述1.3.4节步骤进行前处理，测定不同样品加标回收率。
1.3.6 检出限、定量限和精密度实验
按照上述样品提取条件，按照信噪比不小于3计算检出限（limits of detection，LOD），以信噪比不小于10计算定量限（limits of quantification，LOQ）。根据重复性要求，在同一天和不同日期分别测定10 次PK和MK添加含量为100 ng/g白萝卜样品的重复性，测定不同样品日内与日间的精密度，以RSD计算。
1.4 数据处理
图谱采集和数据处理采用Thermo Scientific TraceFinder TM和Xcalibur数据系统软件（美国Thermo公司）软件。所有实验数据以平均值表示，采用Excel 2010软件进行数据分析和绘图，利用SPSS软件对数据进行统计分析，2 个处理数据采用t检验进行比较，2 个以上处理数据采用两因素方差分析（Two-way ANOVA）进行比较，P≤0.05，差异显著。
2 结果与分析
2.1 质谱条件的优化
通过在流动注射模式下将1.0 μg/mL的2 种VK直接注入离子源中，根据2 种VK的化合物结构，选择在正离子模式下进行优化。采用一级质谱对目标化合物进行母离子全扫描，分析得到[M＋H]＋离子峰；再采用二级质谱，优化碰撞能量等参数，对目标化合物的子离子进行全扫描，每种VK选择2 个信号稳定且强度高的m/z为定性离子对，选择其中信号强度高且受基质干扰小的m/z为定量离子对，优化结果见表2。
表2 VK同系物的分子式和分析条件
Table 2 Molecular formulae and mass spectrometric parameters of VK homologues
注：*.定量离子对。
离子丰度比PK C31H46O2 450.7 8.98 [M＋H]＋ 451.5→187.17* 22.4 0.123 6 451.5→225.08 19.5 MK-4 C31H40O2 444.65 7.31 [M＋H]＋ 445.4→81.05 32.2 0.247 0 445.4→187.13* 21.3化合物 分子式 相对分子质量保留时间/min离子模式 离子对 碰撞能量/eV
2.2 色谱条件的优化
使用反相液相色谱，通过注入5.0 μL质量浓度为100.0 ng/mL标准溶液优化色谱分离条件。分析流动相A和流动相B的不同比例混合流动相对目标物的分离结果。色谱分离的最终选择条件、分析化合物的保留时间以及MS/MS仪器参数如表2所示。化合物的保留时间是通过在同一天范围内进行10 次连续分析和在不同日期进行10 次连续分析而综合确定的。
2.3 样品前处理条件的优化
2.3.1 超声提取步骤的优化
脂溶性维生素分析的食品样品的前处理通常涉及皂化过程、固液萃取和液液萃取过程，有时还需要酶促水解过程[30]。但因VK在皂化性条件下不稳定，所以本方法不采用皂化处理，而采用乙腈作为提取剂提取食物中的VK也已有文献报道[14]，因此本方法采用乙腈进行固液萃取。此外，考虑到光和热对VK稳定性的影响，选择在室温和光线较暗的条件下进行样品处理。使用生菜（添加0.5 μg/g的PK和MK），首先优化样品量（1.0～3.0 g）和提取液乙腈（1～3 mL）的用量比，结果表明使用2 mL乙腈萃取1.5 g样品得到的回收率最高，所以该样液比被选择用于进一步的优化实验；通过在乙腈提取液中添加氯化钠，可以增加维生素向有机相的转移，且可促进相分离，因此比较0.1～0.5 g范围内的不同氯化钠添加量的效果，结果表明添加0.15 g氯化钠可获得最佳结果，而再增加氯化钠的量会降低方法灵敏度，所以选择在乙腈提取液中添加0.15 g氯化钠以提高萃取效率；最后比较使用水浴超声和超声探头直接浸入样品超声的提取效果，结果表明使用超声探头获得的回收率约为使用水浴超声的4 倍，而延长超声探头超声时间并没有提高提取效率，所以采用超声探头辅助萃取方法。
2.3.2 预浓缩过程优化
2.3.2.1 萃取方法的优化
图1 萃取溶剂对萃取效率的影响
Fig. 1 Effects of different extraction solvents on extraction efficiency
比较离子液体-分散液液微萃取法和CPE法对VK的预浓缩。为此，分别用100.0 μL离子液体和非离子表面活性剂、0.5 mL乙腈分散剂和10.0 mL含有100.0 ng/mL分析物的水相分析比较[C6MIm]NTf2、[C8MIm]NTf2、[C12MIm]NTf2、Triton X-114和Triton X-45的预浓缩效果。如图1所示，3 种不同离子液体的离子液体-分散液液微萃取法的富集倍数都只有非离子表面活性剂CPE法的1/3，且CPE法使用的是非有毒试剂，所以本方法采用CPE法对VK进行预浓缩处理，离子液体-分散液液微萃取法和CPE法的比较。
2.3.2.2 萃取溶剂的优化
选择Triton X-45、Triton X-114和Triton X-100为CPE的优化萃取剂，在预实验中使用100.0 μL的0.15 g/mL表面活性剂溶液，并将混合物在恒温水浴中加热并保持相应的浊点温度10 min，当使用Triton X-100时，未获得可收集的表面活性剂富集相，因此不选择该萃取剂。如图1所示，Triton X-45用作CPE的萃取剂时可获得最高的萃取效率。
2.3.2.3 萃取变量的优化
通过单因素试验对影响CPE萃取效率的不同变量进行优化，如图2所示，使用最低表面活性剂和水相体积可获得最佳结果，使用50 μL的Triton X-45可最大程度地降低稀释效果，同时在低表面活性剂浓度下，CPE的萃取效率也得到了保障，当测定体积小于50 μL时，由于回收量太低导致收集富集相困难，所以选择Triton X-45的体积为50 μL；当氯化钠质量浓度为0.4 g/L时VK萃取效率最高；从实用性和时效性分析，用微波炉代替水浴加热步骤可以缩短分析时间且更为方便[31]，因此通过在家用微波炉中将混合物加热20 s（约50 ℃）以获得浊点温度；使用5 mL pH 3～9的0.01 mol/L缓冲溶液作为水相研究供体相pH值对萃取效率的影响，结果表明VK的萃取效率在供体相pH值为7时达到最大值，pH值增加后稍有下降。值得注意的是，需要用30 μL甲醇稀释回收得到的富集相（约15 μL），以降低进样溶液的黏度。综上所述，可以通过快速、绿色且易于操作CPE萃取过程对VK进行预浓缩。
图2 萃取变量对CPE效率的影响
Fig. 2 Effects of extraction parameters on the extraction efficiency of CPE
2.4 线性范围、LOD和LOQ结果
应用ANOVA方差分析，比较用乙醇配制标准溶液和以空白基质溶液配制标准溶液校正曲线斜率，以检查样品基质效应的相关性。由于2 种维生素基质斜率的差异显著性P值均高于0.05，证实样品没有基质效应，可以使用外标法进行定量。
对CPE结合LC-MS/MS方法的线性范围、LOD、LOQ进行研究。结果表明通过使用6 个质量浓度水平的峰面积与分析物质量浓度的最小二乘线性回归分析得到PK和MK在1.0～500.0 ng/mL范围内的良好线性。在所有处理中，PK和MK校正曲线的线性相关系数均高于0.997 0，PK和MK的LOD和LOQ分别为1.0 ng/g和3.2 ng/g、0.8 ng/g和2.8 ng/g。
2.5 方法重复性和精密度结果
根据重复性要求，在同一天和不同日期分别测定10 次加标量为100 ng/g白萝卜样品中PK和MK的重复性，以RSD计算。日内和日间RSD分别为8.8%和9.2%（PK），5.1%和6.3%（MK），表明该方法的精密度良好。
富集因子定义为在萃取相中的分析物浓度与初始样品中分析物的浓度之比。在CPE萃取条件下，PK和MK的富集因子分别为50、45，表明优化的CPE方法可以对PK和MK进行有效预浓缩。表3比较本实验方法与文献报道的测定蔬菜样品中VK的方法，值得注意的是CPE方法首次用于VK的预浓缩，在灵敏度相当的情况下，与以前使用的常规样品处理（例如SPE或微型化前处理DLLME和MSPD）方法相比，CPE具有简单、快速的优点，且避免使用有毒有机溶剂。综上所述，超声辅助提取-CPE与LC-MS/MS结合可用于蔬菜中天然VK的含量分析，最大程度地减少样品处理量和有机溶剂的使用。
表3 蔬菜中VK分析方法的比较
Table 3 Comparison of the developed method with other methods proposed for vitamin K analysis in vegetables
注：超声辅助提取（ultrasound assisted extraction，UAE）；固相支持液相萃取（solid-liquid extraction，SLE）；液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）；二极管阵列检测器（diode-array-detector，DAD）；荧光检测（fluorescence detection，FLD）；同位素稀释（isotopic dilution，ID）；/.该文献未给出LOD。
化合物 样品 检测方法 LOD/（ng/g）参考文献基质 前处理 称样量/g PK、MK 玉米粉、猕猴桃 MSPD 2.0 LC-DAD-APCIMS/MS 0.4～18；1～5 [13]PK 水果、蔬菜 UAE-SPE 5.0 ID-LC-ESI-MS/MS 1.0 [17]PK 甘蓝 SLE-SPE 0.3 LC-DAD / [5]PK、MK、MD 蔬菜 UAE-SPE 1.0 LC-FLD 1.4；0.6；0.8 [9]PK、MK、MD 蔬菜 SLE-DLLME 0.2～2.0 LC-DADAPCI-MS DAD：0.45；0.45；0.3 MS：0.45；0.3；0.75 [14]PK 草药、香料 UAE-SPE 0.05～0.2 LC-FLD / [10]PK、MK 蔬菜 UAE-CPE 1.5 LC-ESI-MS/MS 1.0；0.8 本实验
2.6 回收率和样品含量分析
通过2 个不同类型样品（卷心莴苣和白萝卜）进行低、中、高3 个添加水平的回收实验，加标量分别为40、80 ng/g和120 ng/g，结果见表4，3 个水平的回收率证明从加标样品（白萝卜和卷心莴苣）中提取VK方法的可靠性，其回收率在94.5%～106.2%之间，RSD在3.3%～8.3%之间（n=6），对于样品中的VK能提取完全，说明该方法回收率完全能满足分析要求，结果准确可靠。
表4 加标样品VK回收率
Table 4 Recoveries of spiked samples
化合物 加标水平/（ng/g）卷心莴苣 白萝卜回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%PK 40 105.3±3.5 3.3 96.7±3.9 4.0 80 103.2±5.8 5.6 106.1±4.2 4.0 120 98.4±5.9 6.0 101.5±6.4 6.3 MK-4 40 106.2±4.5 4.2 96.4±8.0 8.3 80 94.5±5.3 5.6 97.3±5.5 5.7 120 95.8±4.9 5.1 103.1±6.4 6.2
表5 蔬菜样品中的VK含量
Table 5 Vitamin K contents in the analyzed vegetables
注：含量为 
（n=6）；/.含量低于LOQ；ND.未检出。
样品 PK含量/（ng/g） MK含量/（ng/g）卷心莴苣 96.2±8 ND上海青 179.4±13 ND菊苣 284.6±16 ND羽衣甘蓝 724.7±33 ND菠菜 1 704.5±68 ND水芹菜 967.4±71 ND白萝 / ND胡萝卜 / ND
图3 混合标准溶液（A）和绿色蔬菜样品（B）PK和MK总离子色谱图及其离子丰度图
Fig. 3 Total ion current chromatograms (TIC) and ion abundance obtained for PK and MK standard mixed solutions (A) and green vegetables samples (B)
通过超声辅助提取-CPE联合LC-MS/MS方法对8 种不同蔬菜的PK和MK进行测定。结果表明卷心莴苣、上海青、菊苣、羽衣甘蓝、菠菜和水芹菜的PK含量为96.2～1 704.5 ng/g（表5），白萝卜和胡萝卜样品中VK含量低于其相应的LOD，所有蔬菜样品均未检测到MK，表明绿叶蔬菜是VK的良好来源，而根茎类蔬菜中VK含量极低，这与PK主要存在于绿叶蔬菜和植物油中，而MK主要存在于肉类、乳制品和发酵食品中的报道一致[1,5]。如图3所示，标准溶液中的MK和PK保留时间分别为7.31 min和8.98 min，相对离子丰度比分别为0.123 6和0.247 0，而样品中的MK和PK的保留时间和相对离子丰度比与标准溶液一致，符合定性要求，证明样品中所测的分析物确为目标物。
3 结 论
本实验建立超声辅助提取-CPE联合LC-MS/MS测定蔬菜中2 种天然VK同系物（PK和MK）的检测方法。应用该方法同时测定8 种常见蔬菜中天然VK同系物的含量。结果表明：该方法操作简单、绿色环保、处理样品量少、结果准确、重复性好，该方法可同时测定PK和MK的含量，且具有回收率高、精密度和灵敏度好等特点。方法对卷心莴苣、上海青、菊苣、羽衣甘蓝、菠菜、水芹菜、白萝卜和胡萝卜8 种蔬菜样品进行检测，检测结果表明蔬菜中仅含有PK，其中白萝卜和胡萝卜未检测到PK，菠菜中含量最为丰富，达1 704.5 ng/g。综上所述，方法应用于日常检测中可降低检测成本，对环境友好，能满足果蔬中天然VK的分析要求，可为政府行政监督提供检测技术支持，具有实际应用价值。
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