我国是世界渔业大国，相关统计[1]显示，2020年水产品产量为6 549.02万 t，比上年增长1.06%。其中，养殖水产品产量达5 224.20万 t，增长了2.86%。然而，水产品在产量逐年递增的同时，由于其营养丰富、含水量高，微生物极易在流通期间大量繁殖，使其发生腐败，目前腐损率在15%左右。现有研究发现，水产品的腐败菌主要有希瓦氏菌、假单胞菌、不动杆菌、气单胞菌等，而腐败希瓦氏菌是导致水产品腐败的主导者之一[2-3]。因此，只有通过适当的处理方式抑制水产品中优势腐败菌的生长繁殖，才能进一步降低其流通腐损率。
超声（ultrasonic，US）是超出人类听力范围的机械波，已被广泛应用于食品杀菌、加速肉类腌制与嫩化、延长肉制品货架期、某些活性物质的辅助提取等方面[4-5]。其中，Antunes-Rohling等[6]研究得出，US（2.9 W/kg）解冻可明显提升鳕鱼鱼片的解冻品质；Pedrós-Garrido等[7]研究发现高强度US（30 kHz、51.41 W/L）处理45 min可显著降低三文鱼、鲭鱼、鳕鱼和无须鳕鱼片微生物数，改善其质量。US在液体介质中传播时，能在液体中形成微小气泡（即空化泡），产生空化效应，该效应被认为是超声波灭菌的主要效应[8]。US技术作为一种非热杀菌技术被应用在食品加工过程中，利用其产生的空化效应来破坏细菌细胞结构，但单独作用时低强度下杀菌效果不明显[9]。Huu等[10]研究发现，用40 kHz US分别处理大肠杆菌和单增李斯特菌，当处理时间低于30 min和45 min时，减菌效果不明显。因此，US有必要结合其他处理技术，以达到提升其杀菌效果的目的[11-12]。
微酸性电解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）是在直流电场的环境下，通过对稀盐酸或稀盐酸与低浓度盐混合液进行无隔膜电解获得的水溶液[13]，pH值为5.5～6.5，有效氯浓度（available chlorine concentration，ACC）为10～30 mg/L，氧化还原电位（oxidation reduction potential，ORP）为700～900 mV，具有特殊理化与杀菌特性，一般公认为安全（generally recognized as safe，GRAS）且环保，已成为苛刻化学消毒剂的流行替代品[14]。SAEW属于新型非热杀菌技术，因其无残留、无污染，且安全高效等特点，在水产品加工前处理与保鲜领域中得到广泛应用。其中，向雅芳等[15]用SAEW对鲈鱼片进行杀菌处理，结果表明SAEW杀菌作用良好，能有效降低样品中的微生物数；冯豪杰等[16]研究得出SAEW处理可有效抑制暗纹东方鲀冷藏期间微生物繁殖，延缓总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量与pH值上升，维持其良好的感官品质，延长冷藏货架期2～3 d。
研究表明，更换US的液体介质，将酸性电解水作为US介质，可提升US的杀菌效果[17]。其中，Li Jiao等[18]利用US与SAEW联合处理金黄色葡萄球菌，能使菌体浓度降低3.68（lg（CFU/mL））；Baumann等[19]研究发现，US-臭氧联用与US单一处理相比，其对单增李斯特菌的杀菌效果提升约30%；Carmen等[20]结果得出，US-万古霉素联合处理能明显提高US对铜绿假单胞菌与大肠杆菌的作用效果；Millan-Sango等[21]研究显示，US结合牛至精油对生菜中大肠杆菌O157:H7的杀菌效果比US单一杀菌提升26%。现有研究主要侧重于US与酸性电解水协同作用对食品品质变化影响与作用效果方面，而对其协同作用机制鲜有研究。基于此，本实验主要探讨了US、SAEW及两者联合处理US+SAEW对腐败希瓦氏菌的作用机制，分别从减菌率、细菌生长曲线、电导率、细胞膜通透性（碘化丙啶（propidium iodide，PI）摄入量）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）与乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）活力、紫外吸收物质泄漏量等指标，结合微观结构观察，综合分析其作用机制，以期为US结合SAEW处理应用于水产品杀菌保鲜提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
腐败希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）由课题组成员从腐败后期的大黄鱼中分离、筛选、鉴定后保存于农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海）。
胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）培养基、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基、氯化钠（NaCl）、硫代硫酸钠、无水乙醇、戊二醛（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；PI染料北京索莱宝科技有限公司；AKP、LDH试剂盒 南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
FX-SWS100型SAEW生成机 烟台方心水处理设备有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Synergy2型自动酶标仪 美国BioTek公司；DDB-11A型电导率仪 杭州齐威仪器有限公司；Mira 3型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 捷克Tescan公司；FE20型pH/ORP计 上海而立环保科技有限公司；RC-3F型高浓度有效氯测定仪 北京航轩科技发展有限公司；M334712型全自动微生物生长曲线分析仪 芬兰Bioscreen公司；UV-2450型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；F-7100型荧光分光光度计 日本日立公司。
1.3 方法
1.3.1 菌悬液与SAEW制备
将保存菌种取出，活化后平板划线培养得到单菌落。挑取活化后的单菌落在TSB培养基中37 ℃振荡培养8 h，随后用质量分数0.85%的无菌生理盐水洗涤3 次并离心（8 000 r/min、10 min）取其沉淀以去除TSB，最后调整菌悬液菌体浓度至106～107 CFU/mL。
通过SAEW生成机电解体积分数9.0% HCl溶液制备SAEW。由pH/ORP计测定其pH值与ORP，由高浓度有效氯测定仪测定其ACC。经测定，所制备SAEW的pH值为6.35±0.04，ORP为（861.6±12.35）mV，ACC为（30.00±1.54）mg/L。
1.3.2 样品处理
将菌悬液分成4 组：对照（CK）组：1 mL菌悬液加入9 mL无菌生理盐水；US组：1 mL菌悬液加入9 mL无菌生理盐水，20 kHz、600 W US处理10 min；SAEW组：1 mL菌悬液加入8 mL SAEW，10 min后加入1 mL终止剂（0.85%（质量分数，下同）NaCl溶液与0.50%硫代硫酸钠），终止灭菌；US+SAEW组：1 mL菌悬液加入8 mL SAEW，20 kHz、600 W US处理10 min后加入1 mL终止剂，终止灭菌。
1.3.3 减菌效果测定
取100 μL不同处理后的菌悬液在TSA培养基上涂布，随后置于37 ℃培养箱中培养24 h后，采用平板计数法进行计数。利用样品杀菌前后的微生物残存率的对数值C表示减菌效果，C绝对值越大，表明减菌作用越强，进行3 次平行实验，计算公式如下。
式中：N0为处理前细菌菌落数/（CFU/mL）；N为处理后细菌菌落数/（CFU/mL）。
1.3.4 微生物生长曲线的测定
将不同处理后的菌悬液按照1%接种量添加于TSB培养基中，置于37 ℃摇床150 r/min培养24 h，每隔1 h用微生物生长曲线分析仪取样测定OD600 nm，每组3 个平行。以培养时间为横坐标，OD600 nm为纵坐标，绘制微生物生长曲线。
1.3.5 电导率测定
将不同处理后的菌悬液按照1%接种量添加于TSB培养基中，置于37 ℃摇床150 r/min培养10 h，分别于0、2、4、6、8、10 h测定其电导率。
1.3.6 PI摄入量测定
菌悬液10 000 r/min、4 ℃离心10 min，弃上清液，用无菌生理盐水重悬，进行PI染料染色。染色后室温黑暗孵化15 min，用荧光分光光度计测定吸光度，激发光波长490 nm，发射光波长635 nm，以菌悬液煮沸10 min为阳性对照组，以吸光度表征PI摄入量。
1.3.7 AKP与LDH活力测定
不同处理的菌悬液分别于0、10 h取样后，按照AKP与LDH试剂盒说明书要求测定其AKP与LDH活力。
1.3.8 对紫外吸收物质泄漏量的测定
将不同处理后的菌悬液按照1%接种量添加于TSB培养基中，置于37 ℃摇床150 r/min培养，分别于0、10 h取样，8 000 r/min离心5 min，使用紫外-可见分光光度计测定其上清液A260 nm（表征核酸含量）和A280 nm（表征蛋白质含量）。
1.3.9 SEM观察
参考Han Qiao等[22]实验方法，将不同处理组的菌液重悬后静置过夜，4 000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀分别用不同体积分数的乙醇溶液梯度脱水后重悬。取适量样品滴至盖破片上晾干，真空镀膜后进行SEM观察。
1.4 数据处理与分析
所有实验进行3 次平行，采用SPSS软件对数据进行分析，采用Duncan’s法进行差异显著性分析和多重比较（P＜0.05为显著性差异），结果以平均值±标准差表示；使用Origin软件制图。
2 结果与分析
2.1 不同处理方式对腐败希瓦氏菌减菌效果的影响
SAEW具有强氧化性，被广泛用于食品原料的清洗杀菌过程中。研究发现SAEW可破坏细胞结构，且能进一步破坏菌体细胞的蛋白质及酶系统，从而杀灭微生物[23]。本实验研究US联合SAEW对腐败希瓦氏菌杀灭效果，其减菌效果如图1所示。
图1 不同处理方式对腐败希瓦氏菌减菌效果的影响
Fig. 1 Effects of different treatments on the inactivation of Shewanella putrefaciens
由图1可知，经不同方式处理后，US、SAEW及US+SAEW组的菌落数分别较CK组减少了0.69、1.55、2.48（lg（CFU/mL））。结果表明，US与SAEW联合处理有协同杀菌作用。可能由于US处理破坏了菌体结构，促进了SAEW进入细胞内部，更直接作用于菌体细胞的酶、蛋白质等，增强其杀菌效果[24]。
2.2 不同处理方式对腐败希瓦氏菌生长曲线的影响
由图2可知，CK组的腐败希瓦氏菌在2 h后快速生长，进入对数生长期，随后在10 h达到稳定期；而菌体经不同处理后，其对数生长期出现相应延滞。其中，US处理组在7 h进入对数生长期，SAEW处理组在9 h后生长速率缓慢上升，对数生长期出现在12～14 h。US+SAEW组的腐败希瓦氏菌生长始终处于低水平，可见其对腐败希瓦氏菌抑制效果明显。该变化趋势与Li Jiao等[18]研究结果一致。
图2 不同处理方式对腐败希瓦氏菌生长的影响
Fig. 2 Effects of different treatments on the growth of Shewanella putrefaciens
2.3 不同处理方式对腐败希瓦氏菌电导率的影响
当微生物细胞处于不利环境中，菌体细胞膜的通透性增加，导致电解质外泄，电导率相应升高[25]。不同处理方式对腐败希瓦氏菌的电导率变化影响如图3所示。
图3 不同处理方式对腐败希瓦氏菌电导率的影响
Fig. 3 Effects of different treatments on the electrical conductivity of Shewanella putrefaciens
由图3可知，随着处理时间的延长，各组菌悬液的电导率相应升高。其中，处理组的电导率较CK组显著上升，尤其是经US+SAEW处理后，其菌悬液的电导率最高（P＜0.05），表明US+SAEW对菌体细胞膜影响最大，菌体细胞膜受到损伤，其保护屏障被打破，致使胞内电解质外泄至培养液中，电导率随之升高[26]。
2.4 不同处理方式对腐败希瓦氏菌细胞PI摄入量的影响
PI是一种大分子荧光染料，其无法进入具有完整质膜的细胞，但可进入膜受损的细胞，并与细胞内DNA和RNA结合[27]。通过对菌体细胞进行PI染色，能测定处理后菌体细胞膜通透性的变化。不同处理方式对腐败希瓦氏菌细胞PI摄入量的影响如图4所示。
图4 不同处理方式对腐败希瓦氏菌细胞PI摄入量的影响
Fig. 4 Effects of different treatments on the PI uptake of Shewanella putrefaciens
由图4可知，与CK组相比，各处理组菌悬液的PI摄入量显著升高（P＜0.05），表明US与SAEW单独或联合处理均对腐败希瓦氏菌的菌体结构带来严重破坏，使PI染料更易进入细胞，其中以US+SAEW处理组的PI摄入量最高，由此说明了US与SAEW联合处理对菌体细胞膜通透性产生显著影响。
2.5 不同处理方式对腐败希瓦氏菌胞外AKP与LDH活力的影响
AKP大多存在于细胞壁与细胞膜间，当细胞结构受到破坏，AKP由胞内渗出。因此，可通过检测细菌胞外AKP活力高低来判断菌体细胞壁的破坏情况[28]。LDH调控细胞的糖酵解途径，当菌体细胞膜受损时，其会由胞内泄漏至胞外，可通过测定其活力高低判断菌体细胞膜的受损程度。不同处理方式对腐败希瓦氏菌胞外AKP与LDH活力变化影响如图5所示。
图5 不同处理方式对腐败希瓦氏菌胞外AKP（A）与LDH（B）活力的影响
Fig. 5 Effects of different treatments on extracellular AKP (A) and LDH (B) activity of Shewanella putrefaciens
如图5A所示，不同处理后的腐败希瓦氏菌胞外AKP活力均显著上升，且在10 h后与0 h差异显著（P＜0.05）。该结果同前期指标分析结果一致，可见US+SAEW联合处理可进一步破坏菌体细胞壁的完整性。迟媛等[9]研究表明US处理在杀菌过程中会作用菌体细胞壁，破坏菌体外层结构，而SAEW也能攻击细胞壁与细胞膜，导致其通透性增加。
由图5B可见，菌悬液经处理10 h后，US、SAEW与US+SAEW处理组的LDH活力分别从0 h的0.34、0.63 U/L与1.15 U/L升至10 h的2.51、2.01 U/L与4.73 U/L，CK组的LDH活力显著低于处理组（P＜0.05）。结果表明，US与SAEW处理均破坏了菌体细胞膜，使菌体内生物大分子外泄，从而达到其杀菌目的，其中，以US与SAEW联合处理作用效果最明显。
2.6 不同处理方式对腐败希瓦氏菌紫外吸收物质泄漏量的影响
核酸与蛋白质的最大吸收波长分别为260 nm和280 nm[29]。因此可以这两处波长下的吸光度表征菌体细胞内部成分泄漏量。不同处理方式对腐败希瓦氏菌紫外吸收物质泄漏的影响如图6所示。相同处理时间下，US+SAEW组样品的核酸（图6A）和蛋白质（图6B）物质泄漏量显著高于US或SAEW单独处理组（P＜0.05）。联合处理导致菌体细胞膜结构的不可逆损伤，使膜透性丧失和细胞质大量渗漏[30]。该结果与AKP、LDH活力变化结果一致。由此可知，US与SAEW联合处理可引起细胞内容物的泄漏，加速菌体死亡的进程。
图6 不同处理方式对腐败希瓦氏菌核酸（A）与蛋白质（B）等紫外吸收物质泄漏量的影响
Fig. 6 Effects of different treatments on leakage of ultravioletabsorbing substances: nucleic acid (A) and protein (B)
2.7 不同处理方式对腐败希瓦氏菌微观结构的影响
由图7可知，CK组菌体细胞饱满完整、形态均匀。经US处理后，细胞形状不规则，菌体表面出现皱褶。经SAEW处理后，部分菌体细胞出现破裂，内容物溶出。而US与SAEW联合处理造成了更严重的损伤，包括细菌表面塌陷、外膜断裂、细胞壁受损，大量内容物外泄。这是由于US处理使菌体细胞的细胞壁和细胞膜受到严重破坏，促进SAEW进入细胞内部，增强其联合杀菌效果。
图7 不同处理方式对腐败希瓦氏菌微观结构的影响（18 000×）
Fig. 7 Effects of different treatments on the microstructure of Shewanella putrefaciens (18 000 ×)
3 结 论
本实验研究了US、SAEW及US+SAEW联合处理对腐败希瓦氏菌的菌体作用机制，通过测定杀菌效果、微生物生长曲线、电导率、PI摄入量、AKP与LDH活力、细胞膜通透性等，初步阐明了US+SAEW处理对腐败希瓦氏菌的作用机理。结果表明，US与SAEW处理的协同效应使腐败希瓦氏菌菌落数减少了2.48（lg（CFU/mL））。联合处理使菌体细胞膜的完整性明显受损，导致其电导率、AKP和LDH活力、紫外吸收值（A260 nm、A280 nm）升高。SEM结果表明，US+SAEW处理严重破坏腐败希瓦氏菌的菌体结构，造成其细胞壁破裂，蛋白质与核酸等细胞质成分的大量外泄。US+SAEW联合处理能使腐败希瓦氏菌菌体生长受到抑制，细胞膜受损，菌体活性降低，最终导致其死亡。因此，将US与SAEW联合处理用于水产品的保鲜加工与前处理具有良好的应用前景。
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