赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是由黑曲霉、赭曲霉或石炭曲霉等真菌产生的次生代谢物[1]，已被国际癌症研究机构列为2B类致癌物[2]。长期以来，在肉类、蛋类、水果和蔬菜、乳制品等多种食品中都监测到了OTA；尤其是谷物、咖啡、葡萄及葡萄相关食品中的OTA污染较为严重[3]，众多研究表明，饮食摄入是人们接触OTA的主要途径，因此各国对食品中的OTA含量也有严格的限量规定。此外，因OTA污染情况较为普遍且其有较高的稳定性，一些常见的日常处理如清洗、加热和过滤等都不能明显降低OTA的含量[4]，因此如何高效清除食品和饲料中OTA成为研究热点。目前用于减少食品中OTA的常用处理方法有生物法、物理法和化学法。物理法包括分离、去皮和清洁等，原理是去除产品被OTA污染最严重的部分；化学法是使用化合物结合或破坏OTA；生物法则是使用微生物及其代谢物将OTA转化、吸附或分解[5]。物理法和化学法会导致食品原料中OTA去除不完全、化学物质残留和二次污染问题[6]，而生物法更能保留食物良好的感官特性和营养质量，并且更加安全和环保[7]。因此生物解毒被认为是减少OTA污染的新策略。
近年来众多研究报道了酵母、芽孢杆菌和无毒真菌等能够通过细胞吸附或产酶降解OTA，而酶法降解OTA因其高效、便捷和不消耗食品本身营养物质而被广泛应用[8]。然而大部分天然酶的本质是蛋白质，其结构并不稳定，很容易受到反应体系中的溶剂、pH值和温度等因素的影响而变性，限制了其在食品工业领域的进一步应用。通过将酶固定则可以解决这一问题，固定后的酶具有稳定性高、可重复性增强、操作成本低且易于分离等优势[9]。各种类型的材料，包括天然或合成聚合物和无机材料，以不同的方式用作酶固定的支持物[10]。众多载体中，金属有机骨架（metal-organic framework，MOF）因孔径均匀、比表面积大、生物相容性良好的优点备受关注[11]。MOF是由金属离子和有机配体（连接体）通过配位键连接而成的纳米晶体材料[12]，在气体储存、药物输送、催化、传感等领域都有广阔的应用前景[13]。目前，研究人员们已经使用不同的MOF对酶进行固定，并在酶催化反应中取得了许多出色的成果[14]。然而目前大多数研究中酶固定的方式主要包括以下步骤：载体的合成、载体的功能化、脂肪酶在固体载体上的固定化[15]。该方式不仅合成时间较长，而且很多MOF需要在极端环境下才能够合成。反之，Zn-MOF作为载体，可通过一步原位固定法实现酶负载，Hou Chen等[16]将葡萄糖氧化酶嵌入到磁性沸石咪唑酯骨架材料-8中实现酶的固定化；Bhardwaj等[17]直接将漆酶固定在Cu-MOF中，固定后的漆酶表现出更高的活性、稳定性和可重复使用性。该方法不仅能够节约合成时间，而且该方法条件温和、固定后的酶稳定性较好，因此可用于OTA降解酶的固定。
源自Aspergillus niger的脂肪酶A（Amano lipase A，ANL），可以通过水解破坏OTA的酰胺键将其转化为赭曲霉毒素α和苯丙氨酸[18]。为提高ANL对OTA的降解效率，本研究采用原位一步合成法将ANL负载到Zn-MOF上，制备Zn-MOF固定化脂肪酶（ANL@Zn-MOF），通过优化合成参数和系列表征技术探究ANL@Zn-MOF的物理化学特性，同时以OTA降解率为评价指标系统探究ANL@Zn-MOF对OTA的降解性能及其影响因素，明确ANL@Zn-MOF循环使用的稳定性，以期为酶法去除食品及饲料中的OTA提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
OTA标准品、NH2-对苯二甲酸（NH2-1,4-dicarboxybenzene，NH2-BDC）、六水合硝酸锌（Zn(NO3)2·6H2O）、NaOH、乙腈（色谱纯）、乙酸（色谱纯） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；黑曲霉脂肪酶A 北京索莱宝科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Essentia LC-16型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配备荧光检测器）日本岛津公司；HC-3016R型高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；Varioskan LUX型多功能酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司；STA7200RV热重-差热分析仪、Nano SEM-450热场发射扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM） 日本日立公司；D8 ADVANCE A25型X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）仪 德国布鲁克公司。
1.3 方法
1.3.1 Zn-MOF和ANL@Zn-MOF的制备
Zn-MOF的合成参考Samui等[19]的方法并略有改进：称取0.027 03 g NH2-BDC和0.01 g NaOH溶于4 mL蒸馏水中，制备成溶液1；随后称取0.023 1 g Zn(NO3)2·6H2O溶解于4 mL蒸馏水中，制备成溶液2。在400 r/min条件下将溶液1滴入到溶液2中，搅拌2 h，形成含有Zn-MOF颗粒的浑浊液。离心收集Zn-MOF沉淀，用10 mL蒸馏水洗涤5 次，并将其置于55 ℃真空烘箱中干燥。
ANL@Zn-MOF的合成方法与Zn-MOF相同，在溶液2中加入ANL，使其充分溶解后进行合成。
1.3.2 ANL@Zn-MOF的表征
取适量的ANL@Zn-MOF（ANL质量浓度为1 mg/mL）和Zn-MOF分散于水中，制备质量浓度为0.5 mg/mL的混悬液，将混悬液滴于硅片上，干燥后喷金，通过SEM观察ANL@Zn-MOF和Zn-MOF的形貌。
将干燥后的样品与KBr混合并压片，采用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）探究ANL固定前后Zn-MOF的表面官能团变化，扫描范围为4 000～400 cm—1。
采用XRD仪对比ANL@Zn-MOF和Zn-MOF的晶体结构，2θ扫描范围为5°～90°。
采用热重-差热分析仪分析ANL@Zn-MOF和Zn-MOF的热稳定性。在N2条件下测试，温度变化范围为30～700 ℃，升温速率为10 ℃/min。
1.3.3 蛋白质含量的测定
通过测定上清液中的蛋白含量计算Zn-MOF对ANL的负载量。根据BCA法测定蛋白质含量，以牛血清白蛋白为标准品，建立标准曲线。采用紫外分光光度计，在562 nm波长处测量吸光度，每个样品至少重复3 次。分别按式（1）、（2）计算Zn-MOF的酶载量及酶固定率：
1.3.4 固定化条件的优化
采用单因素试验，考察反应体系中ANL质量浓度、合成时间及搅拌速率对最终产物降解OTA效率的影响，并以OTA降解率为评价指标，得到最优合成条件。具体方法：在ANL@Zn-MOF合成过程中，控制反应温度为26 ℃，以OTA降解率为参考确定最佳固定化条件。ANL质量浓度分别设置为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mg/mL，固定合成时间为4 h，搅拌速率为600 r/min；合成时间分别设置为1、2、3、4、5、6 h，ANL质量浓度为1.0 mg/mL，搅拌速率为600 r/min；搅拌速率分别设置为200、400、600、800、1 000 r/min，固定ANL质量浓度为1.0 mg/mL，合成时间为2 h。
1.3.5 不同条件下ANL@Zn-MOF对OTA降解效果的测定
采用单因素试验研究反应时间、酶质量浓度、体系pH值、温度、缓冲液浓度以及反应体系体积对ANL@Zn-MOF降解OTA效率的影响，并以相同质量浓度的ANL作为对照。
时间与酶质量浓度的影响：在降解反应体系中加入底物OTA，使其终质量浓度为50 ng/mL，随后添加ANL@Zn-MOF和ANL，设置不同的酶质量浓度梯度，分别为10、20、30 ng/mL。在反应进行的不同时间点（2、4、8、12、24 h）进行取样，以分析时间和酶质量浓度对OTA降解率的影响。
其他因素的影响：保持底物OTA以及ANL@Zn-MOF、ANL的浓度不变，对反应条件进行逐一调控。将反应体系的pH值分别设置为4、5、6、7、8、9，反应温度为45 ℃，磷酸盐缓冲液浓度为10 mmol/L；反应温度分别设置为25、35、45、55、65、75 ℃，反应pH 7.4，磷酸盐缓冲液浓度为10 mmol/L；磷酸盐缓冲液浓度分别设置为4、8、12、16、20、24 mmol/L，反应温度为45 ℃，反应pH 7.4；此外，为考察反应体系体积对降解效果的影响，设置一组扩大100 倍的反应体系，并以原反应体系作为对照，探究不同时间下体系体积变化对降解效率的影响。
实验结束后采用HPLC法测定OTA的剩余量，计算OTA降解率。将反应体系与等体积的乙醇混合，过0.22 μm有机滤膜后完成样品制备。色谱条件：进样量20 μL，流速1 mL/min，流动相为乙腈-水-乙酸溶液（99∶99∶2，V/V）。荧光检测器激发波长为333 nm，发射波长为460 nm。按照式（3）计算OTA降解率：
1.3.6 ANL@Zn-MOF对OTA循环使用性能探究
在反应体系（10 mmol/L磷酸盐溶液）中添加50 ng/mL底物OTA以及ANL@Zn-MOF或20 ng/mL ANL后，在pH 7、40 ℃条件下反应4 h，然后采用HPLC法测定OTA的剩余量并计算OTA降解率。每次反应完成后将ANL@Zn-MOF离心分离，清洗回收，重复反应并测定降解率，循环5 次。
1.4 数据处理与分析
采用Microsoft Office 2016软件进行数据统计；采用Origin 2022软件进行方差分析和绘图。P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 ANL@Zn-MOF的表征结果
为了明确ANL负载后Zn-MOF的理化性质，采用多种表征手段系统探究了Zn-MOF和ANL@Zn-MOF的形貌、晶体结构、表面官能团和热稳定性。由图1a可知，Zn-MOF为板状且大小均匀。与Zn-MOF相比，由0.6 mg/mL ANL制备的ANL@Zn-MOF形状和大小略有变化，但仍为板状（图1b）。随着合成体系中ANL质量浓度的升高，ANL@Zn-MOF仍然保持板状（图1c、d），说明在本实验条件下，Zn-MOF合成体系中ANL的添加量对Zn-MOF的形态基本无显著影响。
图1 Zn-MOF和ANL@Zn-MOF的SEM图像
Fig. 1 SEM images of Zn-MOF and ANL@Zn-MOF
如图2a所示，Zn-MOF中的有机芳香配体在3 340～3 100、1 600～1 550、1 500～1 430 cm—1和900～700 cm—1处有明显的特征峰，其中3 319 cm—1处的峰是由于N—H的伸缩振动。1 558 cm—1和1 398 cm—1处的峰对应羧基的不对称和对称拉伸[20]。1 431 cm—1处的小峰对应与Zn-MOF键合的去质子化羧酸离子[21]；ANL@Zn-MOF的红外光谱不仅存在Zn-MOF的特征峰，而且由于ANL的负载导致ANL@Zn-MOF在3 319 cm—1处的特征吸收峰明显增强，说明ANL@Zn-MOF成功合成。此外，与Zn-MOF相比，ANL@Zn-MOF并未出现新的吸收峰，表明ANL是以物理吸附的方式固定于MOF之中。物理吸附的实现可能是因为ANL@Zn-MOF具有较大的比表面积，为酶的物理固定提供了充足的吸附位点，且其表面存在羧基基团，这些羧基具有较强的极性，能够与酶分子通过氢键和静电相互作用[22]，从而实现了ANL在Zn-MOF上的有效固定。通过对游离ANL和ANL@Zn-MOF的蛋白质结构特征吸收峰分析可知，ANL在1 658 cm—1处的峰值是脂肪酶的α-螺旋结构导致酰胺I键的C＝O拉伸振动[23]，而ANL@Zn-MOF在1 658 cm—1处的峰值移至1 620 cm—1处，这可能是Zn-MOF多孔结构对ANL的束缚导致ANL的α-螺旋结构变为聚集链，且500～700 cm—1酰胺带的峰强度增加进一步证明ANL成功固定于Zn-MOF中。
图2 ANL、Zn-MOF和ANL@Zn-MOF的FTIR（a）、XRD（b）、热重（c）和差热（d）分析
Fig. 2 Characterization of ANL, Zn-MOF, and ANL@Zn-MOF by FTlR (a), XRD (b), thermogravimetric analysis (c) and differential thermal analysis (d)
本实验采用XRD分析ANL@Zn-MOF和Zn-MOF的晶体特性，结果如图2b所示。Zn-MOF在10.7°、19.42°、24.06°、26.14°处有显著的特征衍射峰。同样，ANL@Zn-MOF也显示了Zn-MOF的特征衍射峰，说明Zn-MOF负载ANL前后的晶体结构未发生变化，由于脂肪酶负载到Zn-MOF中，部分衍射峰发生偏移。
为了明确负载前后Zn-MOF的热稳定性，分别测试了ANL@Zn-MOF、Zn-MOF和ANL在30～700 ℃范围内的质量损失，结果如图2c、d所示。对于Zn-MOF而言，在100～160 ℃范围内观察到轻微（近3.38%）的质量损失，主要是Zn-MOF粉末中存在的游离水蒸发所致；在189～224 ℃范围内观察到2.15%的质量损失，这是由于与MOF结构紧密结合的水分蒸发；由于Zn-MOF的结构分解，在380～550 ℃范围内观察到较大的质量损失（近38.71%）。在ANL@Zn-MOF中同样发现，由于MOF和脂肪酶中水分子的损失，在110～180 ℃有相对较大的质量损失（近10.39%）[24]；由于脂肪酶的湮灭，ANL@Zn-MOF的质量损失始于270 ℃左右，一直持续到550 ℃[25]。通过差热分析可知，在120～550 ℃范围内，ANL@Zn-MOF的质量损失率高于Zn-MOF，这种较大的质量损失是因为Zn-MOF中存在ANL，尤其在380 ℃时ANL@Zn-MOF的质量损失比Zn-MOF高约14.4%，这进一步证实了ANL成功固定在Zn-MOF中。
2.2 Zn-MOF对ANL固定的条件优化
为了提高Zn-MOF对ANL负载量，本实验对ANL@Zn-MOF合成时酶的添加量、合成时间及搅拌速率进行了优化，以OTA降解率确定ANL@Zn-MOF制备的工艺参数。如图3a所示，当ANL质量浓度为0.2～1.0 mg/mL时，Zn-MOF对ANL的固定率随酶质量浓度的升高呈先降低后升高的趋势，但当体系中ANL的质量浓度高于1.0 mg/mL时，Zn-MOF对ANL的固定率趋于平稳。当ANL质量浓度为1 mg/mL时，ANL@Zn-MOF对OTA的降解率最高，达到了69.9%。因此，确定在ANL@Zn-MOF制备过程中ANL的质量浓度为1 mg/mL。反应时间不仅影响ANL与Zn-MOF的相互作用，也对Zn-MOF晶体形成至关重要。如图3b所示，Zn-MOF对ANL的固定率和ANL@Zn-MOF对OTA的降解率随着合成时间的延长呈现先增大后减小的趋势。在合成时间为2 h时，ANL@Zn-MOF对OTA的降解率达到最高（71.8%），因此确定ANL@Zn-MOF的最佳合成时间为2 h。搅拌速率影响ANL@Zn-MOF合成体系中各物质之间的相互作用。由图3c可知，在400 r/min的搅拌条件下ANL的固定率最高，达到23.7%，且该条件下制备的ANL@Zn-MOF对OTA的降解率较高（73.0%）。因此，制备ANL@Zn-MOF的最佳条件为ANL质量浓度1.0 mg/mL、合成时间2 h、搅拌速率400 r/min，在该条件下酶载量可达155 mg/g。
图3 固定化条件的优化
Fig. 3 Optimization of immobilization conditions
2.3 ANL@Zn-MOF对OTA的降解分析
2.3.1 体系中ANL浓度和反应时间对OTA降解率的影响
为了明确ANL@Zn-MOF中ANL是否具有OTA降解能力，本实验以游离的ANL为对照，以ANL质量浓度和反应时间为变量，对比了ANL和ANL@Zn-MOF对OTA的降解效果。由图4可知，随着反应时间的延长，二者对OTA的降解率逐渐升高，说明Zn-MOF本身对ANL活性无影响；但在相同的ANL质量浓度条件下，ANL@Zn-MOF对OTA的降解率比ANL高。体系中添加的ANL质量浓度越大，OTA的降解率越高。对于游离的ANL而言，当其质量浓度为20、30 ng/mL时，经过24 h后其对OTA的降解率高达100%，而ANL@Zn-MOF中的ANL质量浓度为10 ng/mL即可在24 h内完全降解OTA，这表明经Zn-MOF固定后显著提高了ANL对OTA的降解能力，且在相同酶浓度下，ANL@Zn-MOF对OTA的降解能力更强，ANL@Zn-MOF（其中ANL质量浓度为20 ng/mL）能在8 h内完全降解OTA，比游离ANL完全降解OTA的时间缩短了66.7%，这可能是因为游离的酶分子在溶液中相比于固定酶更容易发生聚集现象，导致活性位点被遮蔽。而固定化可以将酶分子分散并固定在载体上，避免酶分子之间的相互聚集，保持了酶的活性。同时Zn-MOF可以为ANL提供一个相对稳定的微环境，保护ANL的活性结构，防止其在反应过程中发生变性或失活。这使得ANL能够保持较高的活性，持续有效地对OTA进行降解[26]。
图4 ANL@Zn-MOF（a）和游离ANL（b）的OTA降解率
Fig. 4 Degradation rates of OTA by ANL@Zn-MOF (a) and free ANL (b)
2.3.2 不同条件下ANL@Zn-MOF对OTA的降解情况
2.3.2.1 pH值
体系pH值的变化可以引起酶构象变化或底物电荷特性等性质的改变，对酶活性影响较大[27]。由图5a可知，pH值对ANL@Zn-MOF和ANL的OTA降解能力具有显著影响，随着体系pH值的升高，二者的OTA降解率呈现先上升后下降的趋势，且当pH 7.0时OTA的降解率最高。而在偏酸性和碱性条件下，ANL@Zn-MOF和ANL的活性均降低。这可能是在较低或较高pH值条件下，由于ANL的变性或其构象改变削弱了活性位点与OTA的相互作用。此外，在酸性环境中ANL@Zn-MOF的OTA降解率略低于ANL，在碱性环境中ANL@Zn-MOF对OTA的降解率比ANL高出20%以上。这可能是由于NH2-BDC的羧基带负电荷，降低了ANL吸附位点周围的pH值[28]，因此在反应体系pH值较高的情况下，ANL@Zn-MOF对OTA的降解率仍能保持较高的水平。这种将酶固定后导致其pH值最适区域向酸性或碱性方向转变的情况在其他酶[29]中也观察到。
图5 不同条件下ANL@Zn-MOF对OTA的降解情况
Fig. 5 Degradation of OTA by ANL@Zn-MOF under different conditions
2.3.2.2 温度
温度通过增加自由能水平从而降低或升高酶促反应的活化能，进而改变酶-底物复合物中的相互作用[30]。由图5b可知，随着温度由25 ℃升高至75 ℃，ANL@Zn-MOF和ANL对OTA降解率均呈现先升高后降低，且ANL@Zn-MOF的OTA降解率均高于ANL，尤其是在45 ℃条件下ANL@Zn-MOF对OTA的降解率高达73%。与ANL相比，ANL@Zn-MOF具有较好的热稳定性，在体系温度为65 ℃及以上时，ANL@Zn-MOF仍能够降解体系中的OTA，降解率高于30%。这可能是因为ANL负载在Zn-MOF后其三维构象更加稳定，从而防止其催化中心的变性[31]。
2.3.2.3 体系离子强度
在酶促反应的过程中，底物或酶分子中具有催化作用的氨基酸发生电离，而在离子强度不同的情况下，酶分子的氨基酸残基可能会发生质子化或去质子化反应，并影响底物的结合和转化[32]。而且考虑到ANL特殊的作用机制，反应体系的离子强度会影响ANL活性中心的开放和关闭程度，因此本实验探究了体系中离子强度对ANL@Zn-MOF的OTA降解效果的影响，结果如图5c所示。随着磷酸盐缓冲液浓度的增加，ANL@Zn-MOF和ANL的OTA降解率均呈先升高后降低的趋势，这是因为高离子强度不利于ANL活性中心的暴露，从而影响ANL@Zn-MOF和ANL对OTA的降解能力[33]。值得注意的是，在离子浓度高达24 mmol/L的条件下，ANL@Zn-MOF的OTA降解率比ANL高出20%左右。且ANL@Zn-MOF的OTA降解率始终高于ANL；当磷酸盐缓冲液浓度为12 mmol/L时，ANL@Zn-MOF的OTA降解率达到最高值，为74.8%，ANL的OTA降解率为40.0%。
2.3.2.4 反应体系体积
由图5d可知，随着反应时间的延长，2 种反应体系（5、500 mL）下ANL@Zn-MOF对OTA的降解率均逐渐升高。在相同的时间条件下，5 mL反应体系的降解率始终高于500 mL反应体系。这表明反应体系体积对ANL@Zn-MOF降解OTA的效果有影响。在5 mL的反应体系中，ANL@Zn-MOF对OTA的降解率更高，可能是因为在较小的体系中底物和催化剂的分布相对更加均匀，分子间的有效碰撞几率更高，从而使得降解反应能够更快速有效地进行。而在较大的反应体系（500 mL）中，底物和催化剂的扩散相对较慢，可能导致局部浓度不均匀，影响了反应的进行速度和最终的降解效率[34]。尽管如此，在较大的反应体系下ANL@Zn-MOF仍能在12 h内降解69.3%的OTA。同时，较小体系中OTA的降解率更高也可能是因为受外界干扰因素相对较少，有利于维持反应的高效进行。
2.3.2.5 ANL@Zn-MOF的循环使用性
固定化酶可以循环使用，且在循环使用的过程中能保持酶原有的催化性能[35]，明确固定化酶的循环特性对其工业应用至关重要。如图5e所示，ANL@Zn-MOF对OTA的降解率在使用2 次后缓慢下降，在使用5 次后ANL@Zn-MOF仍能保留78%的相对活性。ANL@Zn-MOF的活性降低可能是由于ANL的分离和失活，以及离心和洗涤过程中固定化酶的损失。对重复使用5 次后ANL@Zn-MOF的形貌观察可知，ANL@Zn-MOF依然保持原来的板状（图5f），说明其具有较好的稳定性，能够根据需求循环使用。
3 结 论
为了解决ANL在降解OTA时存在的稳定性差和难以循环利用的难题，本实验通过一步原位固定法制备了ANL@Zn-MOF，其最优制备条件为酶质量浓度1 mg/mL、合成时间2 h、搅拌速率400 r/min，同时考察了不同pH值、温度、离子强度和反应体系体积条件下ANL@Zn-MOF对OTA的降解情况。结果表明，经Zn-MOF固定拓宽了ANL的温度使用范围，增强了其耐碱性，在pH＞7、温度高于65 ℃和离子浓度高达24 mmol/L的条件下，ANL@Zn-MOF的OTA降解率比ANL高出20%左右，在较大的反应体系下ANL@Zn-MOF仍能在12 h内降解69.3%的OTA。同时ANL@Zn-MOF具有较好的稳定性，循环使用5 次仍能保持其78%的OTA降解能力。本研究可为后续利用ANL@Zn-MOF降解食品体系中的OTA奠定基础。
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