茶多酚是茶叶中具有促进健康的酚类化合物及其衍生物的总称，其中儿茶素是其主要活性组分，而表没食子茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）占儿茶素的50%～70%[1]。EGCG以其优异的抗氧化能力成为儿茶素中最为活跃的成分，其抗氧化活性是VE的20 倍、超氧化物歧化酶的6 倍；同时具备清除自由基、抗癌、抗炎、抗突变、抗衰老及改善肝功能等多种生物活性[2]。EGCG的抗氧化特性源于其化学结构中多个酚羟基的存在，但这一结构也使其容易发生自氧化降解。研究发现，EGCG在高温、中性和碱性条件下稳定性较差，且随着温度、pH值和氧气浓度的升高，其降解速率加快，光照亦会促使其氧化变性[3]。这些特性限制了EGCG在食品中的应用，因此亟需开发有效的EGCG包埋递送体系，以充分发挥其功能性。
目前，提高EGCG稳定性的策略主要包括微胶囊化、脂质体包埋、乳液包埋等，但反溶剂法因其操作简便、可大规模制备等优势，已成为广泛关注的技术之一[4]。该方法通过调控溶剂（如乙醇）与反溶剂（如水）的混合过程诱导分子自组装，形成稳定的纳米颗粒。其中，玉米醇溶蛋白（Zein）因其良好的生物相容性、自组装性及两亲性等特性，广泛用于封装功能成分的纳米颗粒递送系统中[5]。然而，单一的Zein纳米颗粒存在溶解性差、吸收性低及颗粒易聚集等问题，影响体系稳定性。已有研究表明，通过引入多糖、多酚或表面活性剂等物质对Zein纳米颗粒进行修饰，可有效提升其稳定性[6]；而果胶以其生物降解性、安全性、稳定能力和低成本的优点被广泛应用[7]。作为阴离子型多糖的果胶，其丰富的羟基和羧基可与Zein表面的正电荷或氨基基团通过静电相互作用、氢键和分子间网络结构形成稳定的复合体系，从而提高颗粒的分散性与物理稳定性[8]。这种“蛋白-多糖”复合策略有助于构建结构稳定、功能协同的纳米递送系统，已广泛用于活性物质的负载与保护。例如，Wang Xiaojing等[9]采用此法制备Zein-果胶的金丝桃苷（hyperoside，Hyp）递送体系，提高了Hyp的体外抗氧化能力并在胃肠液环境下实现持续释放。此外，Zein-果胶基质还被用于封装二酮类、黄酮类和益生菌等功能成分，均表现出优异效果[5,7,10]。可见，利用Zein与果胶相结合制备负载EGCG的复合纳米颗粒，有望提高EGCG的稳定性与抗氧化性能。
因此，本研究通过反溶剂法制备负载EGCG的柚皮果胶（pomelo-peel pectin，PP）-Zein（PP-Zein/EGCG）纳米颗粒，通过粒径、电位、包封效率等指标对其结构与理化特性进行表征，并探讨EGCG、Zein和PP间的相互作用，优化三者比例以获得性能最优的纳米颗粒。此外，评估复合纳米颗粒的贮藏稳定性及pH值、温度、离子强度和蔗糖质量浓度对其抗氧化性能的影响，以期为提升EGCG稳定性及复合纳米颗粒的抗氧化性能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙田柚 广东省梅州市集贸市场；EGCG 成都钠钶锂生物科技有限公司；Zein 上海源叶生物科技有限公司；商业柑橘果胶（CAS：9000-69-5） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
ME204电子分析天平、DL-400B智能超声波清洗器上海之信仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 上海力辰邦西仪器科技有限公司；JY88-II型超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；PB-10 pH计 德国Sartorius公司；N-1300旋转蒸发仪日本东京理化公司；D3024R台式高速冷冻离心机美国Scilogex公司；DRC-1100冷冻干燥机 南京恒惠科技有限公司；UV-1900i紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；Zetasizer Nano ZSE纳米粒径电位分析仪英国Malvern公司；SU 5000场发射扫描电子显微镜日本日立公司；TENSOR 37傅里叶变换红外光谱仪德国Bruker公司；UItima IV X射线衍射仪 日本理学株式会社；DSC8000差示量热扫描仪 美国PE公司。
1.3 方法
1.3.1 PP的提取和表征
1.3.1.1 PP的提取
参考杜超[11]的方法，略作修改。将新鲜柚子去除果肉后，切块烘干并磨粉，过60 目筛得柚皮粉。称取10 g柚皮粉，加入200 mL 20%柠檬酸溶液，90 ℃搅拌15 min，随后在800 W超声条件下提取15 min。提取液经9 000 r/min离心15 min后，收集上清液，缓慢加入1.5 倍体积95%乙醇溶液（V/V），4 ℃静置过夜。絮状沉淀用300 目筛过滤，沉淀物再次用1.5 倍体积95%乙醇溶液脱色处理，4 ℃静置4 h后过滤，冻干得PP。
1.3.1.2 PP中半乳糖醛酸的测定
采用间羟基联苯法[12]，以D-半乳糖醛酸为标准品，测定PP的半乳糖醛酸含量。取0.6 mL 0.3 mg/mL的PP溶液，于冰水浴中加入3.6 mL 0.012 5 mol/L硫酸-四硼酸钠溶液，旋涡混匀后于100 ℃水浴加热5 min。冷却后加入60 μL 3-苯基苯酚溶液，混匀，测定520 nm波长处的吸光度。通过与半乳糖醛酸标准溶液的标准曲线（线性回归方程为：y＝0.003 3x＋0.056 7，R2＝0.996 7）进行比较，计算PP的半乳糖醛酸含量。
1.3.1.3 PP酯化度的测定
参考Rodsamran等[13]的方法，称取200 mg PP，用2 mL乙醇润湿后溶解于20 mL去除二氧化碳的去离子水中，40 ℃静置2 h。加入酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至粉红色，记录体积（V1）。再加10 mL 0.1 mol/L NaOH溶液静置25 min使其水解，加入10 mL HCl溶液，摇匀至粉红色消失。再次加入酚酞指示剂，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至粉红色，记录体积（V2）。根据式（1）计算酯化度：
1.3.2 PP-Zein/EGCG纳米颗粒的制备
1.3.2.1 PP超声功率对PP-Zein/EGCG纳米颗粒制备效果的影响
PP溶液制备：将0.75 g PP溶于100 mL去离子水（pH 4.0），搅拌（800 r/min，1 h）后离心（5 000 r/min，4 min）去除杂质。为改善PP溶液的分散性与溶解性，进一步以不同超声功率（振幅0%-0 W、振幅10%-180 W、振幅20%-360 W、振幅30%-540 W、振幅40%-720 W）处理PP溶液5 min（脉冲模式：5 s开/5 s关），增强体系的均一性。
随后，将8 g Zein溶于100 mL 80%乙醇溶液（V/V），搅拌（800 r/min，1 h）后加入1.50 g EGCG继续搅拌1 h，离心后取上清液注入4 倍体积pH 4.0去离子水中，旋转蒸发去除乙醇，补水至原体积。最后，将Zein-EGCG溶液滴加至等体积PP溶液中，搅拌（800 r/min，10 min）后离心获得PP-Zein/EGCG纳米颗粒[9]。上述体系中PP、Zein和EGCG的理论质量浓度分别为3.75、8 mg/mL和1.5 mg/mL。
1.3.2.2 PP质量浓度对PP-Zein/EGCG制备效果的影响
基于优化超声功率（540 W），考察PP质量浓度（1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 mg/mL）对包埋效果的影响，其余步骤同1.3.2.1节。
1.3.2.3 Zein质量浓度对PP-Zein/EGCG制备效果的影响
基于优化超声功率（540 W）及PP质量浓度（2.50 mg/mL），考察Zein质量浓度（4、6、8、10、12 mg/mL）对包埋效果的影响，其余步骤同1.3.2.1节。
1.3.2.4 EGCG质量浓度对PP-Zein/EGCG制备效果的影响
基于优化条件（超声功率540 W、PP质量浓度2.50 mg/mL、Zein质量浓度8 mg/mL）下，考察EGCG质量浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）对包埋效果的影响，其余步骤同1.3.2.1节。
1.3.3 PP-Zein/EGCG纳米颗粒包埋效果测定
1.3.3.1 粒径和Zeta电位的测定
将PP-Zein/EGCG纳米颗粒稀释20 倍后，利用动态激光粒度仪测定其平均粒径、Zeta电位及多分散性（多分散指数（polydispersity index，PDI））。
1.3.3.2 包埋率和负载率的测定
采用酒石酸亚铁比色法[14]测定EGCG含量，以EGCG为标准品，以吸光度为纵坐标，EGCG质量浓度为横坐标得到回归方程：y＝0.094 4x＋0.137 1，R2＝0.999 4。
纳米颗粒中的EGCG含量测定参考Huang Xulin等[15]的方法，略作修改。称取200 mg冻干PP-Zein/EGCG纳米颗粒溶解于10 mL去离子水或60%乙醇溶液（V/V）中，涡旋10 min，取上清液测定EGCG含量。根据式（2）、（3）计算包埋率和负载率：
式中：m总为PP-Zein/EGCG纳米颗粒中EGCG总质量/mg；m表为PP-Zein/EGCG纳米颗粒中表面EGCG质量/mg。
1.3.3.3 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的测定
参考Huang Xulin等[15]的方法，略作修改。称取16 mg干燥的PP-Zein/EGCG纳米颗粒溶解于100 mL 60%乙醇溶液（V/V）中，浸泡1 h后，取2 mL浸泡液与2 mL的DPPH自由基溶液混合均匀，室温避光储存30 min。以无水乙醇作参比，用紫外分光光度计测量其在517 nm波长处的吸光度。根据式（4）计算DPPH自由基清除率：
式中：A0为无水乙醇和样品溶液在517 nm处的吸光度；A1为无水乙醇和DPPH自由基溶液在517 nm处的吸光度；A2为样品溶液和DPPH自由基溶液在517 nm处的吸光度。
1.3.3.4 颗粒得率的测定
参考Huang Xulin等[15]的方法，略作修改。将新鲜制备的PP-Zein/EGCG纳米颗粒冷冻干燥并回收称质量，得到干燥的PP-Zein/EGCG纳米颗粒。根据式（5）计算颗粒得率：
式中：m为干燥后的颗粒质量/mg；m1为Zein、EGCG和PP的总质量/mg。
1.3.4 PP-Zein/EGCG纳米颗粒理化性质表征
1.3.4.1 微观形貌观察
用导电胶将干燥的PP-Zein/EGCG纳米颗粒贴于扫描电子显微镜载物台上，在真空条件下对样品进行30 s的喷金，然后在5 kV加速电压条件下检测样品的形貌。
1.3.4.2 傅里叶变换红外光谱分析
将干燥的PP-Zein/EGCG纳米颗粒与溴化钾按照1∶10质量比混合研磨压片，采用红外光谱仪在分辨率为400～4 000 cm—1波数范围内测定纳米颗粒的红外光谱。
1.3.4.3 X射线衍射分析
通过X射线衍射仪对PP-Zein/EGCG纳米颗粒的结晶度进行表征，扫描速率为4（°）/min，扫描角度为4°～80°。
1.3.5 PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性研究
1.3.5.1 热稳定性分析
取25 mL PP-Zein/EGCG纳米颗粒分散液分别放置于50、75、100 ℃恒温水浴锅中，处理120 min后取样。测定样品的粒径、电位、多分散性、EGCG保留率和DPPH自由基清除率，并记录样品外观。
粒径、电位、多分散性测定同1.3.3.1节，DPPH自由基清除率测定同1.3.3.3节，EGCG含量测定同1.3.3.2节，根据式（6）计算EGCG保留率：
式中：m后为处理后PP-Zein/EGCG纳米颗粒的EGCG质量/mg；m总为PP-Zein/EGCG纳米颗粒中EGCG总质量/mg。
1.3.5.2 pH值稳定性分析
取25 mL PP-Zein/EGCG纳米颗粒分散液，用0.1 mol/L HCl和NaOH溶液调节溶液pH值分别为3、5、7、9、11，于室温（（25±1）℃）处理120 min后取样。测定样品的粒径、电位、多分散性、EGCG保留率和DPPH自由基清除率，并记录样品外观。
1.3.5.3 离子强度稳定性分析
取25 mL PP-Zein/EGCG纳米颗粒分散液，分别加入不同量的氯化钠，使得氯化钠最终浓度分别为30、60、90、120、150 mmol/L，于室温（（25±1）℃）处理120 min后取样。测定样品的粒径、电位、多分散性、EGCG保留率和DPPH自由基清除率，并记录样品外观。
1.3.5.4 蔗糖稳定性分析
取25 mL PP-Zein/EGCG纳米颗粒分散液，与不同质量浓度的蔗糖溶液等体积混合，使得混合后蔗糖质量浓度分别为50、100、150、200 mg/mL和250 mg/mL，于室温（（25±1）℃）处理120 min后取样。测定样品的粒径、电位、多分散性、EGCG保留率和DPPH自由基清除率，并记录样品外观。
1.3.5.5 贮藏稳定性分析
取25 mL PP-Zein/EGCG纳米颗粒分散液，放置于4 ℃和25 ℃环境中，分别于0、7、14、21、28、35、42 d取样。测定样品的粒径、电位、多分散性、EGCG保留率和DPPH自由基清除率，并记录样品外观。
1.3.6 体外消化释放分析
参考黄如梦[16]的方法，配制模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）、模拟小肠液（simulated intestinal fluid，SIF）和模拟结肠液（simulated colonic fluid，SCF）。取0.5 g冻干PP-Zein/EGCG纳米颗粒，加入10 mL SGF，于37 ℃、100 r/min条件下振荡120 min，每隔30 min取1 mL消化液测定EGCG含量和DPPH自由基清除率，并及时补充等体积释放介质。胃液消化完成后，离心收集沉淀，加入10 mL SIF，继续振荡，每隔40 min取样测定。SIF消化完成后，离心收集沉淀，加入10 mL SCF，振荡至纳米颗粒破裂，每隔1 h取样测定。根据式（7）计算EGCG释放率：
式中：m消为消化液中EGCG质量/mg；m总为PP-Zein/EGCG纳米颗粒中EGCG总质量/mg。
1.4 数据处理
使用Origin 2022软件作图，采用SPSS 19.0软件中Duncan法进行显著性分析，当P＜0.05时为具有显著性差异。
2 结果与分析
2.1 PP表征分析
半乳糖醛酸是衡量果胶纯度的重要指标，结果见表1。GB 25533—2010《食品添加剂 果胶》规定果胶中半乳糖醛酸质量分数应大于65%。本研究中，PP的半乳糖醛酸质量分数为73.86%，满足商品果胶标准。
表1 果胶酯化度及半乳糖醛酸含量
Table 1 Esterification degree and galacturonic acid content of pectin
注：同列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。
样品半乳糖醛酸质量分数/%酯化度/%PP73.86±2.42b65.46±0.66b商业柑橘果胶80.90±0.96a74.01±0.80a
酯化度表示甲酯化半乳糖醛酸的比例，从表1可知，本研究中PP酯化度为65.46%，属于典型的高酯果胶范畴[11]。研究表明，高酯果胶能够通过形成稳定的复合网络结构，提高蛋白-多糖体系的乳化性和稳定性，从而增强对活性物质的包埋和保护作用[17]。本研究提取的PP具良好结构特性，适合构建稳定的复合体系，具有良好的应用潜力。
2.2 制备条件对PP-Zein/EGCG纳米颗粒的影响
2.2.1 PP超声功率对纳米颗粒稳定性及包埋效果影响
超声破碎可有效增强PP溶液的均匀性，从而利于制备高稳定性纳米颗粒。如图1所示，基于未超声处理PP溶液制备的纳米颗粒呈深黄色，粒径和PDI分别为1 752.33 nm和0.528，EGCG包埋率仅为89.45%，表明颗粒较大且分布不匀，易发生聚集或沉淀，导致体系稳定性较差并影响包埋效果。随着超声功率增加，机械振动和空化作用破坏聚集结构，使PP溶液溶解性和均匀性得到提高[18]。当超声功率为540 W时，粒径进一步降低，PDI达到最小值，包埋率、负载率和DPPH自由基清除率分别为98.18%、11.13%和32.9%，表明体系稳定性最佳。进一步增加功率导致溶液PDI增大、电位绝对值和包埋率降低，说明超声作用过强会破坏果胶分子链，导致其不能有效稳定纳米颗粒[19]。因此，540 W为PP溶液的最佳超声功率。类似研究表明，超声处理可促进Zein和阿拉伯胶的相互作用，增强对柠檬油的负载[20]。
图1 不同超声功率处理对PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性及包埋效果的影响
Fig. 1 Effects of ultrasonic power on the stability and encapsulation effect of PP-Zein/EGCG nanoparticles
2.2.2 PP质量浓度对纳米颗粒稳定性及包埋效果影响
PP作为一种天然多糖，具有良好的生物相容性，是理想的包埋壁材[11]。如图2所示，随着PP质量浓度的变化，溶液颜色变化较小。当PP质量浓度从1.25 mg/mL增至2.50 mg/mL时，粒径从1 204.67 nm降至1 096.33 nm，PDI及Zeta电位分别降至0.367和—25.43 mV，表明PP通过增强静电排斥及氢键作用优化了颗粒分散性。同时，PP质量浓度较低时，PP分子不足以完全包覆Zein-EGCG分子，导致颗粒疏水聚集[21]，包埋率仅为96.15%；PP质量浓度增至2.50 mg/mL时，PP通过其负电荷与疏水核层形成稳定核壳结构[22]，包埋率提升至100%。然而，PP质量浓度超过2.50 mg/mL时，由于分子自交联和多层黏附效应增强，导致颗粒尺寸增大、PDI升高、包埋率和EGCG抗氧化活性同步下降[21]。因此，PP质量浓度为2.50 mg/mL时效果最佳。类似现象在Liu Jiawen等[6]的研究中也有报道，壳聚糖浓度过高会导致纳米颗粒聚集，造成粒径增大和PDI升高。
图2 PP质量浓度对PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性及包埋效果的影响
Fig. 2 Effects of pomelo-peel pectin concentration on stability and encapsulation effect of PP-Zein/EGCG nanoparticles
2.2.3 Zein质量浓度对纳米颗粒稳定性及包埋效果影响
PP-Zein/EGCG纳米颗粒利用Zein的疏水性及与PP分子间的相互作用，形成稳定结构[5]。如图3所示，当Zein质量浓度为4 mg/mL时，粒径和PDI仅为635.23 nm和0.301，溶液颜色较浅，推测是因为蛋白分子不足导致自组装受限，核壳结构不完整[23]，EGCG包埋率仅为84.1%。随着质量浓度增加至8 mg/mL，溶液颜色加深，粒径、PDI和电位分别增至1 096.33 nm、0.367和—25.43 mV，归因于Zein分子增多促使核层增厚、颗粒尺寸增大，同时PP的静电吸引降低表面电荷密度，形成稳定的核壳结构，实现EGCG完全包埋[24]。然而，当质量浓度超过10 mg/mL时，过量的玉米蛋白引发分子竞争性聚集，导致有效参与包埋的蛋白比例下降，颗粒理化性质发生变化[6]；当Zein质量浓度为12 mg/mL时，EGCG包埋率、抗氧化活性及颗粒得率分别降至89.55%、25%和60.05%。因此，Zein质量浓度为8 mg/mL时效果最佳。
图3 Zein质量浓度对PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性及包埋效果的影响
Fig. 3 Effects of zein concentration on the stability and encapsulation effect of PP-Zein/EGCG nanoparticles
2.2.4 EGCG质量浓度对纳米颗粒稳定性及包埋效果影响
优化EGCG质量浓度有助于提升纳米颗粒的理化稳定性和包埋效果，从而增强其环境耐受性与应用潜力。如图4所示，不同EGCG质量浓度条件下制备的纳米颗粒外观颜色变化较小。随着EGCG质量浓度从0.5 mg/mL增加到2.5 mg/mL，粒径、PDI和Zeta电位绝对值均呈上升趋势，表明更多的EGCG被包埋在复合体系中，核层增厚进而引起粒径和PDI的增加[24]。然而，当EGCG质量浓度达到2.5 mg/mL时，EGCG分子过多，超出复合体系的包裹能力，部分EGCG吸附于外层，包埋率降至94.08%，并干扰颗粒形成，导致得率下降[25]。Liang Jin等[26]也发现，EGCG封装率随着质量浓度增加呈先升高后下降的趋势。因此EGCG质量浓度为2.0 mg/mL时效果最佳。
图4 EGCG质量浓度对纳米颗粒稳定性及包埋效果的影响
Fig. 4 Effects of EGCG concentration on the stability and encapsulation effect of PP-Zein/EGCG nanoparticles
综上所述，最终确定优化的反溶剂法制备条件为：PP质量浓度为2.50 mg/mL，并进行540 W的超声处理，Zein和EGCG的质量浓度分别为8 mg/mL和2.0 mg/mL；在此条件下，制备的PP-Zein/EGCG纳米颗粒粒径、PDI和Zeta电位分别为1 124.33 nm、0.374和—25.67 mV；EGCG在纳米颗粒中实现完全包埋，其负载率为15.37%，DPPH自由基清除率为41.8%，颗粒得率为79.18%。
2.3 PP-Zein/EGCG纳米颗粒理化性质表征
2.3.1 微观形貌分析
采用扫描电子显微镜观察冻干后的PP-Zein/EGCG纳米颗粒形貌，结果如图5a所示。颗粒呈球形或近似球形，表面光滑，存在一定粘连现象，可能与PP作为外层包覆材料的黏附性有关，这既促进了颗粒聚集，也有助于稳定颗粒结构，防止冻干过程中崩解[27]。与溶液状态下的水合粒径（1 124.33 nm）相比，扫描电子显微镜测得的干态粒径为130 nm，粒径减小可能是溶液中颗粒易因静电相互作用和吸引力而发生聚集，导致粒径较大；而在冻干过程中，水分的去除使得颗粒收缩并破坏了聚集结构，从而使粒径减小[28-29]。总体而言，PP-Zein/EGCG纳米颗粒保持了良好的球形结构，有助于其在不良环境中的稳定性。
图5 PP-Zein/EGCG纳米颗粒的理化性质表征
Fig. 5 Characterization of physicochemical properties of PP-Zein/EGCG nanoparticles
2.3.2 傅里叶变换红外光谱分析
通过傅里叶变换红外光谱分析Zein、PP、EGCG及PP-Zein/EGCG纳米颗粒的结构和相互作用，结果如图5b所示。Zein和PP分别在3 318 cm—1和3 423 cm—1处的宽峰与—OH拉伸振动有关，在纳米颗粒中—OH拉伸峰出现轻微偏移，表明Zein与PP之间存在氢键作用[8]。对于Zein，在1 661 cm—1和1 529 cm—1处的吸收峰分别代表酰胺I和酰胺II带；而纳米颗粒的酰胺I峰移至1 637 cm—1处，酰胺II峰移至1 581 cm—1处，表明Zein、PP和EGCG之间存在静电相互作用[30]。此外，具有特征性的EGCG峰（3 556、3 478、3 356 cm—1和3 274 cm—1）在纳米颗粒中未观察到，考虑到Zein和EGCG均具有疏水基团，推测EGCG通过氢键和疏水作用被封装在颗粒中[31]。
2.3.3 X射线衍射分析
通过X射线衍射分析Zein、PP、EGCG及PP-Zein/EGCG纳米颗粒的相互作用（图5c），结果表明：EGCG为晶体材料，在5°～40°范围内呈现多个特征结晶峰；Zein和PP分别于9°、20°及22°处显示宽峰，表明二者为无定形结构[26]。PP-Zein/EGCG纳米颗粒的X射线衍射与PP相似，仅出现弱化宽峰，表明PP有效包覆核层物质。并在纳米颗粒中未检测到EGCG的特征衍射峰，表明EGCG成功被包裹在纳米颗粒中[32]。这与Wang Xiaojing等[9]基于果胶-Zein包封体系的研究结论一致。
2.4 PP-Zein/EGCG纳米颗粒的稳定性分析
2.4.1 热稳定性分析
不同温度条件下PP-Zein/EGCG纳米颗粒的稳定性如图6所示。总体而言，随着温度升高，颗粒的粒径、PDI及Zeta电位先降低后升高，而EGCG保留率和DPPH自由基清除率则逐渐下降。具体地，在50 ℃加热2 h后，颗粒的外观未发生显著变化，粒径和PDI略微下降，这可能是低温加热促进了颗粒内部的分子重排，使结构更紧密并提高了体系均匀性[33]。当温度升至75 ℃时，纳米颗粒的外观依然保持稳定，但较高温度引发了轻微的聚集现象，导致粒径和PDI有所增加[34]。100 ℃加热处理后，溶液由黄色变为淡黄色，并伴有沉淀现象。颗粒絮凝形成更大的粒子，粒径和PDI大幅上升至2 598 nm和0.521，Zeta电位升至—24.93 mV，表明颗粒分布不均且出现严重的聚集。尽管如此，处理后的纳米颗粒EGCG保留率为93%，DPPH自由基清除率为37.4%，仍显著高于未包埋EGCG，表明包埋体系在高温条件下具有较好的保护作用。
图6 热处理对PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性的影响
Fig. 6 Effect of heat treatment on the stability of PP-Zein/EGCG nanoparticles
2.4.2 pH值稳定性分析
考察PP-Zein/EGCG纳米颗粒的pH值稳定性，结果如图7所示。在pH 3和5的酸性环境中，纳米颗粒的外观稳定，EGCG的保留率达99%，抗氧化活性良好。然而，在中性和碱性环境中，纳米颗粒逐渐沉淀，粒径和PDI增大。在pH 11时，溶液变为红棕色并产生黄色沉淀，粒径和PDI为2 072.9 nm和0.661，EGCG保留率和DPPH自由基清除率降至69.1%和28.1%。这是由于在碱性条件下，Zein表面负电荷增加，削弱了其与PP之间的静电吸引，导致颗粒结构松散甚至解体，从而引起粒径、PDI和Zeta电位急剧变化[35]。同时，蛋白质因疏水作用重新聚集，形成沉淀；外泄的EGCG发生氧化和异构化，生成红棕色产物并影响溶液颜色[36]。在整个过程中，PP-Zein/EGCG纳米颗粒的EGCG保留率和抗氧化活性均高于游离EGCG，证明PP-Zein/EGCG纳米颗粒对EGCG具有一定的保护作用。
图7 不同pH值处理对PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性的影响
Fig. 7 Effect of pH on the stability of PP-Zein/EGCG nanoparticles
2.4.3 离子强度稳定性分析
PP-Zein/EGCG纳米颗粒在不同离子强度下的稳定性如图8所示。当盐浓度从30 mmol/L增加至90 mmol/L时，纳米颗粒溶液的外观无明显变化，但粒径、PDI和Zeta电位逐渐增加。在盐浓度为150 mmol/L时，粒径增至1 748 nm，PDI升高至0.607，Zeta电位升至—20.73 mV，并出现聚集及黄色沉淀。这可能归因于电荷中和作用进一步降低颗粒的静电稳定性，削弱空间位阻效应，使颗粒发生聚集或重组，导致其自组装行为和分散性受到破坏[37]。尽管高盐环境影响颗粒稳定性，PP-Zein/EGCG纳米颗粒仍表现出较好的EGCG保护能力。在30～150 mmol/L的盐浓度范围内，EGCG保留率始终高于90%，DPPH自由基清除率保持在37.6%～41.7%，显著优于游离EGCG（150 mmol/L时保留率降至85.6%）。这与Joye等[38]的研究结果一致，通过蛋白和果胶包被后可提高活性成分在高盐浓度下的稳定性。
图8 不同离子浓度处理对PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性的影响
Fig. 8 Effects of NaCl concentration on the stability of PP-Zein/EGCG nanoparticles
2.4.4 蔗糖稳定性分析
研究PP-Zein/EGCG纳米颗粒在蔗糖环境的稳定性，有助于评估其在高糖食品中的应用潜力，提高活性成分在复杂食品基质中的保护能力，结果如图9所示。在50～250 mg/mL蔗糖质量浓度范围内，纳米颗粒溶液的外观保持一致，未观察到肉眼可见的沉淀；其粒径先略增大后降低，PDI稳定在0.367至0.394之间，Zeta电位保持在—25 mV左右。250 mg/mL蔗糖质量浓度时，EGCG的保留率为98.7%，DPPH自由基清除率为40.6%。这些结果表明，负载EGCG的纳米颗粒在蔗糖环境中表现出较高的稳定性，具有较强的糖耐受性。
图9 不同蔗糖质量浓度处理对PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性的影响
Fig. 9 Effects of sucrose concentration treatments on the stability of PP-Zein/EGCG nanoparticles
2.4.5 贮藏稳定性分析
进一步评估了PP-Zein/EGCG纳米颗粒在不同贮藏温度条件下的稳定性，如图10a、b所示，在4 ℃贮藏条件下，纳米颗粒的粒径、PDI和Zeta电位在初期（7、14 d）有所下降，随后逐渐增大，表明低温下静电斥力得到维持保持，粒子较为稳定[39]。但随着贮藏时间延长，氢键和疏水作用的增强逐步削弱静电斥力，导致颗粒聚集，35 d后溶液出现沉淀，粒径和PDI增大，溶液颜色变浅并出现沉淀，表明稳定性逐渐下降[40]。相比之下，25 ℃条件下纳米颗粒的稳定性下降更为剧烈，初期粒径和PDI略微下降，但较高的环境温度下，纳米颗粒表面电荷密度发生变化，聚集和沉淀现象加剧，42 d后粒径和PDI急剧增加，Zeta电位绝对值大幅下降，表明颗粒稳定性明显降低。
图10 4 ℃及25 ℃贮藏对PP-Zein/EGCG纳米颗粒稳定性的影响
Fig. 10 Effects of storage temperature on the stability of PP-Zein/EGCG nanoparticles
图10c、d为贮藏期内EGCG保留率及抗氧化能力的变化，其中，4 ℃贮藏42 d后，EGCG的保留率为85.9%，DPPH自由基清除率为34.38%；而在25 ℃条件下，两者分别降至71.8%和30.09%。4 ℃和25 ℃贮藏42 d后，纳米颗粒的EGCG保留率分别为未包埋的1.10 倍和1.46 倍。这些结果表明，PP-Zein/EGCG纳米颗粒能有效延缓EGCG的降解，并在低温贮藏条件下表现出更好的稳定性。
2.5 PP-Zein/EGCG纳米颗粒的体外消化释放特性分析
PP-Zein/EGCG纳米颗粒在模拟胃肠液中的消化稳定性及EGCG释放行为如图11所示。游离EGCG在SGF（pH 2.0）中较稳定，2 h内含量无明显变化。然而，进入SIF（pH 6.8）后其含量迅速下降，消化后相对含量仅剩40.3%，抗氧化活性大幅降低。进入SCF（pH 7.4）4 h（即整体消化10 h）后，EGCG相对含量低至5%以下，因其在中性和碱性环境中易发生异构化和自氧化降解，而致其生物利用度较低[41]。相比之下，PP-Zein/EGCG纳米颗粒在消化过程中具有更优的稳定性和缓释特性。在SGF中，PP外层吸水膨胀并质子化，形成保护层，抑制EGCG过早释放，2 h后EGCG释放率仅为15.9%。进入SIF后，PP去质子化并膨胀，但受PP与Zein之间的疏水相互作用及氢键作用的影响，EGCG释放受控，至SIF消化80 min（即整体消化3.3 h）释放率增至31.6%。然而，随着消化时间延长，SIF中的消化酶及碱性环境加速EGCG降解，使其活性和抗氧化能力逐渐下降[41]。在SCF阶段，PP逐渐被降解，颗粒结构崩解后EGCG释放加快；同时在弱碱性环境下EGCG降解加剧，使EGCG含量和DPPH自由基清除率先升后降。总体而言，PP-Zein/EGCG纳米颗粒通过核壳结构提供了有效的保护作用，避免EGCG的快速释放和降解，使其具有更强的生物利用度。
图11 EGCG（a）、PP-Zein/EGCG纳米颗粒（b）在模拟胃肠液中的EGCG含量及DPPH自由基清除率变化
Fig. 11 EGCG (a) and PP-Zein/EGCG nanoparticles (b) in simulated gastrointestinal fluid: changes in EGCG content and DPPH radical scavenging rate
3 结 论
本研究通过反溶剂法制备PP-Zein/EGCG纳米颗粒，并对其制备工艺、结构特性及稳定性进行分析。确定了最佳制备工艺条件为：PP质量浓度为2.50 mg/mL，并进行540 W的超声处理，Zein和EGCG的质量浓度分别为8 mg/mL和2.0 mg/mL。在此条件下制备的颗粒粒径较小且分布均匀，实现EGCG完全包裹和高负载，整体抗氧化活性较强。X射线衍射和微观形貌显示EGCG被有效包裹在颗粒内部并形成球形结构，傅里叶变换红外光谱进一步证实PP-Zein/EGCG通过氢键、疏水效应和静电作用对EGCG进行负载和保护。在多种环境条件下的稳定性实验中，PP-Zein/EGCG纳米颗粒相较于游离EGCG展现出更优的稳定性，尤其在高温、酸碱、离子强度及高糖环境中能够较好地保持其稳定性。在4 ℃和25 ℃的贮藏条件下可有效保持颗粒稳定性和EGCG活性，延缓其降解。在模拟胃肠液消化过程中，颗粒的核壳结构可有效防止EGCG的快速释放及氧化降解。总而言之，本研究通过PP-Zein/EGCG纳米颗粒成功实现了EGCG的包埋和运载，为开发具有较高生物利用度和稳定性的生物活性物质递送系统提供了理论依据和实践参考。
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