韩国泡菜加工过程中微生物区系的研究
甘 奕，李洪军，付 杨，贺稚非*，倪冬冬
（西南大学食品科学学院，重庆市特色食品工程技术研究中心，重庆 400716）
摘 要：为了解韩国泡菜在制作过程中微生物的区系，分离鉴定其在腌制、发酵过程中的优势微生物。结果表明：韩国泡菜腌制过程中优势乳酸菌经鉴定为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；优势酵母菌为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、粗状假丝酵母（Candida valida）；韩国泡菜在发酵过程中的优势乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）；优势酵母菌为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、粗状假丝酵母（Candida valida）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
关键词：韩国泡菜；优势微生物；分离鉴定
韩国泡菜（kimchi）以新鲜蔬菜为主要原料，佐以姜、蒜、葱、萝卜和各种水果以及盐、辣椒面等调味料，经盐腌、拌料，在低温条件下经微生物发酵而成，堪称韩国“第一菜”
［1］；与德国的酸甜甘蓝、西欧的酸黄瓜、中国涪陵榨菜并称世界四大酱腌菜。
韩国泡菜因其热量低，含有丰富的营养物质，具有维持人体肠道健康
［2］、抗菌
［3-4］、抗肥胖
［5］、抗衰老
［6］、抗肿瘤
［7］等特点，并因旅游业的发展而受到国内外消费者的喜爱。韩国每年大约消耗145 万t泡菜，1996年韩国泡菜生产量为29.5 万t，到2002年为50 万t
［8］；1999年韩国本土的泡菜市场产值大约是2 万亿韩元（约合16.7 亿美元）
［9］，至今每年销售收入达到24 亿美元以上
［10］；其品种已超过190 种
［11］，并由原本的家庭作坊生产进入到工业化生产的成熟期
［12］。泡菜的英文名“Kimchi”也被尼斯国际商品分类目录收录
［13］；2008年通过俄罗斯生物医学研究中心的不懈努力SK（太空泡菜）可以作为太空食品进入太空，并且保质期可以达到30 d
［14］。如何高产、高质量地生产出韩国泡菜对韩国泡菜产业的发展十分重要。若能参照制备酸奶发酵剂对韩国泡菜进行直投式发酵，不仅能加快发酵速率、提高泡菜的品质
［15-16］，更能较好地推动泡菜产业的发展。而目前的研究主要集中于四川泡菜
［17-18］，针对韩国泡菜的研究较少。
研究表明，明串珠菌类（Leuconostoc citreum）、融合乳杆菌（Weissella confusa）、沙克乳杆菌（Lactobacillus saker）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）对泡菜风味口感有着重要的作用
［19］。微生物种类随泡菜品种的不同而不同
［20］，并受地域及腌制季节影响
［21］。因此，对韩国泡菜生产过程中菌种的分离鉴定及菌种特征等的研究具有一定的经济效益和社会效益。
本实验以韩国泡菜为研究对象，分离鉴定其在腌制、发酵过程中的优势微生物，以期为提高产品质量提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
大白菜、面粉、海盐、白萝卜、韭菜、红萝卜、姜、苹果、梨、糖，均购于重庆永辉超市；韩国辣椒粉、鱼露购于韩国乐天超市。
1.2 仪器与设备
FA2004分析天平 上海精密科学仪器有限公司；SS-325高压灭菌锅 日本Tomy公司；DHP-9272电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台 江苏苏净安泰空气技术有限公司；MJ-160霉菌培养箱 上海跃进医疗器械厂；B203生物显微镜重庆奥特光学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 韩国泡菜的制作
将新鲜的整棵白菜竖切分成两半或四等份，用海盐均匀涂抹在每层白菜叶表面，室温腌制8～10 h后清水清洗并将水排尽；将红萝卜、白萝卜、韭菜切成细丝；苹果、梨、姜制成泥状；取少量面粉，煮成熟面粉；调料配制：向熟面粉里加入适量韩国辣椒面、鱼露、白糖、盐、（苹果、梨、姜）泥，搅拌后加入萝卜丝、韭菜丝；将配好的调料由白菜芯开始均匀地抹于每一片白菜叶，直至外层的叶子抹完；用最外层叶子将白菜包住，将辣白菜整齐地放进容器里；放有泡菜的容器放入0～4 ℃冰箱。
1.3.2 微生物区系的分离鉴定
选择腌制第6小时、发酵第15天的泡菜样品的计数平板分离纯化进行微生物的鉴定。
1.3.2.1 划线分离
分别从泡菜腌制阶段和发酵阶段的MRS培养基、PDA培养基计数平板的表面以及内部挑取外观形态不一样的菌落，分别在MRS培养基、PDA培养基采取交叉划线法，划线3～4 次，直至培养得出纯菌落。
1.3.2.2 菌种保存
将分离得到的微生物纯菌落接种于相应的斜面培养基，编号、记录，适宜环境中充分生长后，放置于4 ℃冰箱内贮藏。
1.3.2.3 菌种活化
微生物鉴定实验前，将贮藏于冰箱内的菌种进行活化。无菌操作，用接种环挑取斜面培养基所保藏的菌种，在相应培养基上划线分离并培养。
1.3.2.4 微生物的鉴定
乳酸菌的鉴定方法：参照《伯杰细菌鉴定手册》
［22］。
菌落形态观察：菌落的大小和形状、边缘、表面、透明度、隆起形状、菌落及培养基的颜色等。
细胞形态的观察：挑取纯单菌落进行革兰氏染色并用显微镜油镜观察细胞形状和排列方式。
生理生化特征的鉴定：主要包括生长NaCl耐受性实验、接触酶实验、精氨酸产氨实验、硝酸盐还原实验、生长温度耐受性实验、生长pH值耐受性实验、M.R.实验、糖醇发酵实验、V.P.实验等。具体操作及培养基的配制均参照《伯杰细菌鉴定手册》。
酵母菌的鉴定方法：参照《酵母菌的特征与鉴定手册》
［23］。
菌落形态观察：菌落大小、表面形状、凸起、边缘、表面光泽、菌落质地、透明度、气味等。
细胞形态的观察：取菌落于载玻片上，直接用显微镜观察细胞形态和排列方式。
生理生化特征的鉴定：主要包括碳源同化实验、氮源同化实验、产类淀粉化合物实验、耐高渗透压实验，观察掷孢子、假菌丝、子囊孢子等。具体操作方法参照《酵母菌的特征与鉴定手册》。
2 结果与分析
2.1 韩国泡菜中优势乳酸菌的分离鉴定结果
表1 韩国泡菜腌制和发酵过程中乳酸菌分离结果
Table 1 Lactic acid bacteria isolated from kimchi during pickling and fermentationation
编号来源菌落形态特征细胞形态特征（10×100）A-1MRS圆形，白色，直径0.5～1.2 mm，表面光滑，中间凸起G
+杆状，两个链状A-2MRS圆形，白色，直径0.5～1.0 mm，表面光滑，中间凸起G
+杆状，两端钝圆，多呈短链A-3MRS圆形，边缘整齐，白色，直径1.0～2.0 mm，表面光滑，中间凸起，有光泽G
+杆状，短链B-1MRS圆形，边缘整齐，白色，直径1.0～2.0 mm，表面光滑，凸起，有光泽G
+短杆，成对或呈链状B-2MRS圆形，边缘整齐，淡黄色，直径2.0 mm，表面光滑，低凸起G
+杆状，单个或二联B-3MRS圆形，边缘整齐，白色，直径约1.0 mm，表面光滑，凸起，有光泽G
+杆状，呈两个或短链状排列B-4MRS圆形，边缘整齐，黄色，直径1.0～2.0 mm，扁平G
+杆状，短链B-5MRS圆形，边缘整齐，黄色，直径1.0 mm，扁平G
+杆状，短链B-6MRS圆形，边缘整齐，白色，直径0.5～1.0 mm，表面光滑，中间凸起G
+杆状，短链，单个或二联B-7MRS圆形，边缘整齐，白色，直径0.5～1.2 mm，表面光滑，中间凸起G
+短杆，二联B-8MRS圆形，边缘整齐，白色，直径0.5～1.0 mm，表面光滑，凸起G
+杆状，两端钝圆B-9MRS圆形，边缘整齐，乳白色，直径0.5～1.0 mm，中间凸起，有光泽，不透明G
+卵圆形，成对或链状
从腌制6 h韩国泡菜的各乳酸菌计数平板上总共挑取6 株形态不同的菌落，经分离纯化及形态学初步鉴定，筛选出3 株形态与细胞形态各不相同的乳酸菌进行鉴定，编号A-1、A-2、A-3；从发酵15 d韩国泡菜的各乳酸菌计数平板上总共挑取15 株形态不同的菌落，经分离纯化及形态学的初步鉴定，筛选出9 株菌落形态及细胞形态各不相同的乳酸菌进行鉴定，分别编号为B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6、B-7、B-8、B-9。乳酸菌分离结果见表1及图1。
图1 韩国泡菜腌制和发酵过程中乳酸菌菌落形态与细胞形态（10×1000）
Fig.1 Colonial morphology and micro-morphology of lactic acid bacteria （10 × 100）
根据表2实验结果，对照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》初步鉴定出：A-1、A-2、B-6、B-7、B-8为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）；A-3、B-1、B-2、B-3为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；B-4、B-5为弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）；B-9为肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）。即腌制过程中主要的细菌是短乳杆菌、植物乳杆菌；发酵过程中主要的细菌除短乳杆菌、植物乳杆菌外；还有弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）；肠膜明串珠菌肠膜亚种。这主要因为韩国泡菜为低温低盐制得，以异型发酵为主，使得泡菜产品的酸味较淡、风味柔和饱满。
表2 乳酸菌的鉴定结果
Table 2 Results of lactic acid bacterial identification
注：+. ≥90%菌株为阳性；－. ≥90%菌株为阴性；d. 11%～89%菌株为阳性；+w. 阳性到弱反应。下同。
鉴定实验A-1A-2A-3B-1B-2B-3B-4B-5B-6B-7B-8B-9硝酸盐还原实验++++++－－++++精氨酸产氨实验++－－－－++++++接触酶实验－－－－－－－－－－－－生长NaCl耐受实验2 g/100 mL++++++++++++ 3.5 g/100 mL++++++++++++ 5 g/100 mL++++++++++++ 6.5 g/100 mL++++++++++w++ 10 g/100 mL－－+－－－+－－－－d 15 g/100 mL－－－－－－－－－－－－生长温度耐受实验4 ℃－－－－－－－－－－－d 10 ℃－－－－+－－－－－－+ 15 ℃+++++－++－－－+ 20 ℃+++++－++++++ 40 ℃+++++－+++++d 45 ℃－－+++－－－－－－－生长pH值耐受性实验pH 4.5++++++－－++++ pH 5.5++++++++++++ pH 7++++++++++++ pH 8.5++++－－－－++++ M.R.实验dd+－－－++ddd+ V.P.实验－－－+++－－－－－－糖醇发酵实验葡萄糖++++++++++++麦芽糖++++++++++++半乳糖d+w++－d++ddd+果糖+++d++++++++ D-木糖d－d+++－－ddd+蔗糖dd++++－－ddd+甘露糖－－++dd++－－++甘露醇－－+d++－－++++ L-阿拉伯糖++d+++－－++++丙三醇+++++++++++－
2.2 韩国泡菜中优势酵母菌的分离鉴定结果
表3 韩国泡菜腌制和发酵过程中酵母菌分离结果
Table 3 Yeasts isolated from kimchi during pickling and fermentation
编号来源菌落形态特征细胞形态特征（10×40）L-1虎红琼脂圆形，边缘整齐，乳白色，直径2.0～2.5 mm，光滑湿润，低凸起，有光泽，易挑取卵圆形，菌体较大，一端芽殖L-3虎红琼脂圆形，边缘整齐，白色，直径3.0 mm，不透明，有光泽圆形，无假菌丝N-1虎红琼脂圆形，边缘整齐，乳白色，直径约2.5 mm，光滑湿润，低凸起，有光泽，易挑取卵圆形，菌体小，一端芽殖L-2虎红琼脂圆形，边缘整齐，乳白色，直径2.5 mm，光滑湿润，低凸起，有光泽，易挑取卵圆形，菌体小，无假菌丝N-2虎红琼脂圆形，边缘整齐，乳白色，直径2.0～2.5 mm，光滑湿润，低凸起，有光泽，易挑取卵圆形，菌体较，无假菌丝N-3虎红琼脂圆形，边缘整齐，白色，直径2.5～3.0 mm，不透明长圆形，无假菌丝N-4虎红琼脂圆形，边缘整齐，白色，直径约2.5 mm，不透明，有光泽圆形，无假菌丝N-5虎红琼脂圆形，边缘整齐，乳白色，直径3.0～3.5 mm，光滑湿润，有光泽圆形，无假菌丝，有子囊孢子
从腌制6 h韩国泡菜的各虎红琼脂计数平板上总共挑取5 株形态不同的菌落，经分离纯化及形态学初步鉴定，筛选出3 株形态与细胞形态各不相同的酵母进行鉴定，编号L-1、L-2、L-3；从发酵15 d韩国泡菜的各虎红琼脂计数平板上总共挑取8 株形态不同的菌落，经分离纯化及形态学的初步鉴定，筛选出5 株菌落形态及细胞形态各不相同的乳酸菌进行鉴定，分别编号为N-1、N-2、N-3、N-4、N-5。酵母菌分离结果见表3与图2。
图2 酵母菌菌落形态与细胞形态（10×400）
Fig.2 Colonial morphology and micro-morphology of yeasts （10 × 40）
表4 酵母菌的鉴定结果
Table 4 Results of yeasts identification
实验项目L-1L-2L-3 N-1 N-2 N-3 N-4 N-5葡萄糖++++++++半乳糖++++++++乳糖－－－－－－－－麦芽糖++++++++蔗糖++++++d+甘露醇++d+++wd+甘露糖+++w++d+w+阿拉伯糖++d+++d+纤维二糖－－－－－－－－淀粉－－－－－－－－肌醇－－－－－－－－同化氮源硝酸钾－－－－－－－－硫酸铵++++++++产类淀粉化合物－－－－－+++耐高渗透压50%+++w++d+w－60%－－－－－－－－37 ℃生长++++++++掷孢子+++－－－－－子囊孢子－－+－－+++假菌丝－－－－－－－－同化碳源
根据表4碳源同化实验、氮源同化实验及其他生化反应结果，对照《酵母菌的特征与鉴定手册》初步鉴定出：L-1、L-2、N-1、N-2为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）；L-3、N-3、N-4为粗状假丝酵母（Candida valida）；N-5为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。即腌制的过程中主要的酵母菌是近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、粗状假丝酵母（Candida valida）；发酵过程中除这两种酵母外，还有酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。由于韩国泡菜属于部分需氧、部分厌氧发酵，其挥发性风味物质中主要包括乙酸等物质
［24］，因此与四川泡菜相比，韩国泡菜成熟后略带酒精的风味。
3 结 论
本实验结果表明，在韩国泡菜的不同制作阶段，其优势微生物种类不同。在腌制过程中的优势乳酸菌为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）；腌制过程中优势酵母菌为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、粗状假丝酵母（Candida valida）。韩国泡菜在发酵过程中的优势乳酸菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）；优势酵母菌为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、粗状假丝酵母（Candida valida）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
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Microflora of Kimchi during Production
GAN Yi， LI Hongjun， FU Yang， HE Zhifei*， NI Dongdong
（Special Food Engineering and Technology Research Center of Chongqing， College of Food Science， Southwest University，Chongqing 400716， China）
Abstract：In order to explore the microflora of kimchi during the production process， the predominant microorganisms were isolated and identified. The results showed that during the pickling process of kimchi， the dominant lactic acid bacteria were Lactobacillus brevis and Lactobacillus plantarum； the dominant yeasts were Candida parapsilosis and Candida valida. The dominant lactic acid bacteria in kimchi during fermentation were Lactobacillus plantarum， Lactobacillus curvatus，Lactobacillus brevis and Lactobacillus mesenteroides subsp. mesenteroides； the dominant yeasts during fermentation were Candida parapsilosis， Candida valida， and Saccharomyces cerevisiae.
Key words：kimchi； dominant microorganisms； isolation and identification
中图分类号：TS255.54
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2015）15-0118-05
doi：10.7506/spkx1002-6630-201515022
收稿日期：2014-09-19
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（200903012）
作者简介：甘奕（1989—），女，博士研究生，研究方向为食品质量与安全控制。E-mail：Lizzie_ganyi@hotmail.com
*通信作者：贺稚非（1960—），女，教授，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail：2628576386@qq.com
