罗非鱼（Oreochromis mossambicus）是我国大宗经济养殖鱼类，它具有繁殖力强、肉质细嫩有弹性、肌间刺少、营养成分均衡、市场售价适中、烹饪方法多样等特点，被广大消费者所喜爱[1]。中国是最大的罗非鱼生产国和贸易国[2]；但受微生物作用，水产品通常短时间内就会腐败变质，从而导致货架期缩短、经济价值降低[3]；因此急切需要研究一种新型高效的水产品贮藏保鲜方法[4]。
冰藏是水产品贮藏的理想方式，因为它不仅能提供低温而且还能提供高湿度的贮藏环境[5]；用自来水冰（tap water ice，TWI）对水产品进行贮藏是一种常见的快速抑制微生物生长的方法，但是TWI不能有效杀灭菌体，水产品食用前一旦离开冰暴露在空气中，附在产品上面的菌体就会迅速繁殖，加速水产品腐败[6]。用含有杀菌物质的冰对水产品进行贮藏保鲜，不仅能抑制水产品表面菌体的繁殖，还能杀灭菌体，从而延长水产品的货架期。
微酸性电解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）又称次氯酸水，是一种新型的杀菌剂，它已被证明对人类和环境无害[7-8]。微酸性电解水冰（slightly acidic electrolyzed water ice，SAEWI）近些年已开始在食品工业中应用，它不仅具有TWI的优点，而且还有杀菌的潜力。但是SAEWI在罗非鱼片保鲜中的应用还鲜有文献报道，因此本研究以罗非鱼片为原料，探讨SAEW制备成的碎冰对罗非鱼片贮藏保鲜的效果，以期为SAEWI在罗非鱼片以及水产品加工保鲜中的应用提供参考。
新鲜罗非鱼购于广州市海珠区华润超市，每条鱼质量约为500～600 g。
浓盐酸、氯化钠等分析纯 广州化学试剂厂；平板计数琼脂培养基 广州环凯微生物科技有限公司。
SAEW实验机 烟台方心水处理设备有限公司；SQ510C型立式压力蒸汽灭菌锅 重庆雅马拓科技有限公司；SPX-320型生化培养箱 宁波江南仪器厂；IS128实验室pH计 上海仪迈仪器科技有限公司；MIR254低温恒温培养箱 日本Sanyo公司；Ultra Turrax T25D型均质机德国IKA工业设备公司；HWS24型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台苏州净化设备有限公司；JJ500型电子天平 常熟市双杰测试仪器厂；BCD-171CH冷冻箱 博西华家用电器有限公司；1100高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪（配有二极管阵列检测器） 美国安捷伦公司。
1.3.1 SAEW的制备及其指标测定
采用SAEW实验机，电解体积分数3%的稀盐酸溶液，制备所需不同的有效氯浓度（available chlorine concentration，ACC）的SAEW，其pH值、氧化还原电位（redox potential，ORP）值采用pH计直接测定，ACC的测定用碘量法[9]，每个指标重复测定3 次，得到SAEW的ACC、ORP、pH值见表1。
表1 SAEW的理化特性
Table 1 Physicochemical properties of slightly acidic electrolyzed water (SAEW)
名称 ACC/（mg/L） pH ORP/mV SAEW 1 12.48±0.47 6.39±0.06 882.93±9.00 SAEW 2 19.85±1.71 6.16±0.09 898.54±19.03 SAEW 3 31.39±1.48 6.05±0.19 900.63±14.30 SAEW 4 40.27±1.36 5.89±0.09 910.23±15.83
1.3.2 SAEW最佳ACC的确定
在室温条件下，将罗非鱼切成（10.0±0.3）g的鱼片，实验组使用SAEW 1、SAEW 2、SAEW 3和SAEW 4 浸泡罗非鱼片，浸泡时间设为2、5、10 min和15 min，以未处理组（0 min）为空白对照组，处理完毕后迅速将鱼片沥干转移到无菌封口袋内（每个袋内1 片鱼片），分析SAEW的ACC和浸泡时间对罗非鱼片的减菌效果，得出SAEW的最佳ACC和处理时间，每组实验进行3 次平行，结果取平均值。
1.3.3 SAEWI的制备
用无菌封口袋分别装取3 L SAEW 3（最佳ACC）和自来水，放置于-20 ℃冰箱保存48 h分别制成SAEWI和TWI，然后用经过乙醇消毒的铁锤把制取的SAEWI和TWI敲碎，制成大约2.0 cm×1.5 cm×1.0 cm的碎冰，用无菌封口袋装取部分SAEWI和TWI，在70 ℃水浴条件下融化，之后测其ACC、ORP及pH值，对以上每个指标重复测定3 次，得到SAEWI和TWI的ACC、ORP、pH值（表2）。
表2 SAEWI和TWI的理化特性
Table 2 Physicochemical properties of SAEWI and TWI
名称 ACC/（mg/L） pH ORP/mV SAEWI 20.00±1.35 6.32±0.04 886.23±7.00 TWI 0 6.95±0.14 346.00±5.00
1.3.4 罗非鱼片的覆冰保鲜实验
将罗非鱼片修剪为5.0 cm×2.0 cm×1.0 cm的大小，随机分成SAEWI组和TWI组，按照层鱼层冰的方式分别放置于50 cm×30 cm×20 cm的泡沫箱内，将泡沫箱封口置于1 ℃恒温培养箱中，每隔1 d换1 次冰，每隔4 d从两组鱼片中随机抽取3 片进行感官评价并测定其pH值、总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量、K值和菌落总数。
1.3.5 罗非鱼片的感官评价
感官评定参考文献[10]并略加改动，对鱼片的色泽、组织形态、气味和肌肉弹性4 方面进行评定，具体评分规则见表3。每片鱼片经6 名接受过评估训练的人员进行感官评价，鱼片的综合分值16～20 分为新鲜，9～15 分为品质良好，8 分以下为品质发生明显劣变。
表3 罗非鱼片感官评定标准
Table 3 Criteria for sensory evaluation of tilapia fillets
颜色暗淡，肌肉切面无光泽组织形态 肌肉组织致密完整，纹理很清晰指标 好（5 分） 较好（4 分） 一般（3 分） 较差（2 分） 差（1 分）色泽 颜色鲜艳，肌肉切面有光泽颜色正常，肌肉切面有光泽颜色稍暗淡，切面稍有光泽颜色较暗淡，肌肉切面无光泽肌肉组织不紧密，松散气味 生鱼肉肌肉组织紧密，纹理较清晰肌肉组织不紧密，但不松散肌肉组织不紧密，局部松散固有的腥味 固有腥味稍淡 固有腥味较淡，略带异味固有腥味消失，异味明显完全无腥味，有轻微臭味肌肉弹性坚实富有弹性，手指压后凹陷立即消失坚实有弹性，手指压后凹陷较快消失较有弹性，手指压后凹陷消失较慢稍有弹性，手指压后凹陷消失很慢无弹性，手指压后凹陷不消失
1.3.6 罗非鱼片的pH值测定
参考吴燕燕等[11]的方法，略有改动。称取碎鱼肉10.00 g，加入10 mL 0.15 mol/L氯化钾溶液，用均质器13 000 r/min均质30 s，获得匀浆，使用pH计测定匀浆的pH值，每个处理做3 个平行。
1.3.7 罗非鱼片的TVB-N含量测定
TVB-N含量的测定参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮》中的半微量定氮法[12]，单位为mg/100 g。每个处理做3 个平行。
1.3.8 罗非鱼片的K值测定
参考李莎等[13]的方法进行HPLC检测。HPLC条件：色谱柱Capcettpak C18（4.6 mm×150 mm），柠檬酸8.4 g、醋酸2 mL和12 mL三乙胺混和后，用超纯水定容至1 L，得到流动相进行洗脱；上样量10 μL，流速0.8 mL/min，柱温40 ℃，采用紫外检测器在260 nm波长处检测。每个样品平行测定3 次，取平均值。鱼肉中腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）按ATP→腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）→腺苷酸（adenosine monophosphate，AMP）→肌苷酸（inosinemonphosphate，IMP）→次黄嘌呤核苷（hypoxanthine riboside，HxR）→次黄嘌呤（hypoxanthine，Hx）的途径降解，其K值按公式（1）计算。
式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx表示相应物质的含量/（μmol/g）。
1.3.9 罗非鱼片菌落总数的测定
菌落总数的测定参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[14]，并适当修改。无菌条件下每份样品取5 g鱼肉，剪碎于无菌锥形瓶中，加入45 mL无菌生理盐水，梯度稀释制备10 倍系列梯度的菌悬液，取两个合适稀释度的稀释液，吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做3 个平皿，及时将15～20 mL冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀，待琼脂凝固后将平板翻转，于（30±1）℃培养72 h后计数。杀菌率按公式（2）计算。
实验数据利用Microsoft Excel 2016软件整理，利用SPSS软件进行单因素方差分析，结果以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著。
图1 不同ACC的SAEW对罗非鱼片杀菌效果的影响
Fig. 1 Effect of ACC of SAEW on sanitization of tilapia fillets
如图1所示，4 种不同ACC的SAEW对罗非鱼片均有明显的杀菌效果，在0～10 min范围内，同一ACC的电解水对罗非鱼片的杀菌效果均随浸泡时间延长而显著增大（P＜0.05），其中浸泡2 min时，SAEW 1、SAEW 2、SAEW 3和SAEW 4对罗非鱼片的杀菌率分别为42.25%、56.54%、64.29%和68.33%，而浸泡10 min时，它们的杀菌率已分别达到63.56%、74.77%、82.14%和86.67%，但10～15 min时，同一ACC的电解水杀菌效果随浸泡时间延长变化不显著（P＞0.05）；同一浸泡时间时，SAEW的杀菌效果随ACC增加显著增大（P＜0.05），而ACC大于31.98 mg/L（SAEW 3）时，其杀菌效果增加不显著（P＞0.05），因此后续选取SAEW 3制取SAEWI进行电解水冰保鲜实验。
图2 罗非鱼片在不同条件下贮藏过程中感官评分的变化
Fig. 2 Sensory scores of tilapia fillets during storage in TWI or SAEWI
如图2所示，前4 d两组鱼片的感官评分均随贮藏时间延长变化不显著（P＞0.05），4 d后两组鱼片的感官评分均随贮藏时间延长而显著降低（P＜0.05）；贮藏周期内SAEWI组的感官评分始终高于TWI组，前4 d两组之间感官评分无显著性差异（P＞0.05），8 d后两者之间差异显著（P＜0.05）。TWI组鱼片感官评分第12天开始低于8 分，此时鱼片已明显劣变，而SAEWI组第16天低于8 分。但仅以感官评分无法判断鱼片的货架期，需结合其他品质指标综合判断SAEWI和TWI对鱼片货架期的影响。
图3 罗非鱼片在不同条件下贮藏过程中pH值的变化
Fig. 3 pH changes of tilapia fillets during storage in TWI or SAEWI
由图3可知，SAEWI、TWI组鱼片的pH值均随贮藏时间的延长先减小后增大，pH值减小是由于鱼肉中的糖原糖酵解产生了乳酸[15]；而随着贮藏时间的延长pH值又开始增加，这是由于蛋白质的降解以及碱性菌的繁殖产生了氨化合物以及三甲胺等碱性物质[16]。两组鱼片前4 d pH值随着时间延长均变化缓慢，推测可能因为鱼片转入低温环境，鱼肉中酶的活性受到抑制，糖原酵解产乳酸较缓慢，而且鱼片表面微生物暂时不适应低温环境，生长繁殖较缓慢，因此前期pH值变化缓慢。SAEWI组与TWI组在前8 d的pH值不存在显著性差异（P＞0.05），而12 d后，SAEWI组鱼片的pH值显著低于TWI组，说明SAEWI能有效地抑制鱼肉中微生物的生长，进而抑制鱼肉中pH值的增大。
图4 罗非鱼片不同条件下贮藏过程中TVB-N含量的变化
Fig. 4 TVB-N content changes of tilapia fillets during storage in TWI or SAEWI
TVB-N含量作为鱼肉新鲜度的一个重要指标，与鱼肉中的内源性酶和微生物活动有着紧密的关联[17-18]。由图4可知，SAEWI和TWI组罗非鱼片的TVB-N含量随着贮藏时间延长显著增加（P＜0.05），TWI组从初始的9.3 mg/100 g增加到16 d的27.17 mg/100 g，其中第12天时TVB-N含量达到18.68 mg/100 g，接近淡水鱼TVB-N含量可接受值（20 mg/100 g），而SAEWI组从初始的9.2 mg/100 g增加到16 d的20.17 mg/100 g。在16 d贮藏期间SAEWI组的TVB-N含量始终低于TWI组，而前4 d两组之间的TVB-N含量不存在显著性差异（P＞0.05），8 d以后差异显著（P＜0.05）。在贮藏过程中鱼片TVB-N含量不断增加是由于附着在鱼体表面的腐败微生物不断繁殖产生的脱羧酶、脱氨酶等酶类以及鱼体内源性蛋白酶分解的肽类、氨基酸类等发生脱羧脱氨反应，生成氨和胺类等物质，另外微生物本身能产生大量胞外蛋白酶，其作用于蛋白质也能产生大量含氮物质[19]。与TWI组相比，SAEWI能有效抑制TVB-N含量的增加，表明SAEW具有高效的杀菌性能，能抑制微生物的生长进而抑制氨和胺化物的产生[20]。
图5 罗非鱼片不同条件下贮藏过程中K值的变化
Fig. 5 K value changes of tilapia fillets during storage in TWI or SAEWI
鱼死亡后，其体内的ATP会依次降解成ADP、AMP、IMP、HxR和Hx。K值为反映鱼肉新鲜度的一个重要指标，其大小能反映鱼肉的腐败程度，通常鱼肉K值小于20%时，处于一级鲜度，在20%～40%时为二级鲜度，40%～60%时鱼肉已发生早期腐败，为三级鲜度；一般认为K值60%是鱼肉可食用的极限值，而大于60%表示鱼肉已腐败不能再食用[21]。由图5可知，在贮藏的前4 d，SAEWI和TWI组鱼片的K值均随贮藏时间的延长而缓慢增加（P＞0.05），4 d后两组鱼片的K值均随贮藏时间延长而显著增加（P＜0.05），其中TWI组的K值由初始的10.22%增加到第12天的60.42%，而SAEWI的K值由初始的9.56%增加到第16天的61.56%；在贮藏期内，SAEWI组鱼片的K值均低于TWI组，其中前4 d两组之间不存在显著性差异（P＞0.05），8 d后，SAEWI组的K值显著低于TWI组（P＜0.05）。
如图6所示，两组鱼片在前4 d贮藏期间，菌落总数均缓慢下降（P＞0.05），这可能是部分微生物不适应低温环境而不能生长[22]，4 d后两组鱼片的菌落总数均随贮藏时间的延长显著增加（P＜0.05），TWI组鱼片的菌落总数从初始值3.45（lg（CFU/g））增加到第12 天的6.10（lg（CFU/g）），此时已达到水产品中微生物数量可接受的极限值（6.00（lg（CFU/g））），而SAEWI组到第16天达到6.02（lg（CFU/g））；在整个贮藏期间内，SAEWI处理组的菌落总数始终低于TWI组，且贮藏8 d之后两者之间存在显著性差异（P＜0.05）；推测SAEWI和TWI在短期贮藏期间对鱼片贮藏效果一致，而长期贮藏SAEWI可显著延长鱼片货架期，这是因为SAEWI溶解后产生SAEW，进而达到抑菌杀菌的作用[23-24]。
图6 罗非鱼片不同条件下贮藏过程中菌落总数的变化
Fig. 6 Changes in total viable count of tilapia fillets during storage in TWI or SAEWI
货架期是指当食品在一定的贮藏条件下，能够保持其理想的感官、理化和微生物特性的一段时间[25]。微生物的活动是引起鱼肉腐败变质的关键因素[26]，SAEWI的保鲜机理为：SAEWI具有低温、高湿度的特点，且含有有效杀菌成分次氯酸分子，因此贮藏过程中，一方面低温和高湿度的条件能抑制微生物生长繁殖；另一方面，SAEWI随贮藏时间延长不断溶解成SAEW，而SAEW中的有效杀菌成分次氯酸分子可作用于菌体细胞，不仅可与细胞壁发生作用，而且因其分子质量小、呈电中性，因而易于进入细胞内与蛋白质发生氧化作用或破坏其磷酸脱氢酶的活性，使糖代谢失调而致死细胞，进而达到保鲜的效果[27]。综合本研究的各项鲜度指标结果可知，1 ℃贮藏条件下，SAEWI组鱼片的菌落总数、TVB-N含量、K值和感官评分均在15～16 d达到或超过可接受值，可知SAEWI可保存罗非鱼片15～16 d；而TWI组鱼片的菌落总数、TVB-N含量、K值和感官评分在11～12 d超过可接受值，可知TWI可保存罗非鱼片11～12 d，SAEWI可有效延长罗非鱼片货架期3～4 d。Lin Ting等[28]研究在常温且敞口条件下酸性电解水冰和TWI对对虾的保鲜效果，发现电解水冰组对虾货架期为6 d，比TWI组货架期长1 d，这与本实验结果略有不同，推测可能是本研究中的冰温贮藏及封闭条件延缓了冰的融化，换冰频率降低，降低了外界污染的几率，因此本研究中鱼片货架期相对较长。黎柳等[19]研究了电解水冰（pH值为2.49±0.01、ORP为（1 115.0±0.5）mV、ACC为（28±1）mg/kg）鲳鱼在1 ℃条件下的冷藏保鲜效果，发现TWI组的鲳鱼货架期为10 d，而电解水冰组的鲳鱼货架期可延长至19 d，该结果与本研究类似，但优于本实验结果，推测是强酸性的电解水对微生物的抑制作用优于SAEW。Jung等[29]研究0～1 ℃条件下SAEWI（ACC＝45 mg/L，pH 5.07）对棕色鳎目鱼货架期的影响，发现TWI可保存鳎目鱼9～10 d，而SAEWI可保存11～12 d，与本研究结果一致。由上述文献结果可知，SAEWI结合低温可有效抑制微生物的生长繁殖，维持产品良好品质，延长产品货架期，同时得知电解水在一定条件下，酸性越强，SAEWI的效果越好；因此在水产品加工保鲜过程中，适当降低贮藏温度和SAEWI的pH值，有助于水产品的保鲜。
鱼肉鲜度影响其制品品质，直接决定产品的最终价值[30]。评价鱼肉鲜度常用的指标有感官评分、pH值、TVB-N含量、K值及菌落总数等[31]。在本研究中，鱼片贮藏初期，在相同贮藏时间内SAEWI组与TWI组的罗非鱼片各品质指标均缓慢变化且两者之间不存在差异性，而随着贮藏时间的延长，两组之间的品质指标差异逐渐显著；推测贮藏前期低温的作用相比电解水的作用更显著，电解水的影响作用在贮藏后期更加显著。Lin Ting等[28]研究酸性电解水冰和TWI对对虾的保鲜效果，结果为两组对虾的TVB-N含量均随贮藏时间延长而增加，且前3 d两组之间不存在显著性差异（P＞0.05），3 d之后两组之间存在显著性差异（P＜0.05）；Kim等[32]研究发现，在秋刀鱼4 ℃贮藏过程中，前13 d电解水冰组和TWI组pH值不存在显著性差异（P＞0.05），从第14天开始，两者之间存在显著性差异（P＜0.05）；Wang Jingjing等[18]用电解水冰和TWI处理对虾，18 ℃黑暗贮藏6 d，发现电解水冰组和TWI组pH值在前5 d不存在显著性差异（P＞0.05），而5 d后两组之间差异显著（P＜0.05）；与本研究结果变化趋势一致，皆为前期两组指标之间差异不显著，后期差异显著。综上，采用SAEWI低温条件下保存水产品贮藏后期效果较显著，但前期与TWI比较效果差异不明显，因此需要更深入地研究SAEWI对水产品的影响，以扩大其在各类水产品中的应用。
相比TWI，SAEWI能抑制贮藏期间鱼片菌落总数、TVB-N含量、K值和贮藏后期pH值的增加，且鱼片感官评分也相对较好，可将罗非鱼片货架期有效延长3～4 d。因此SAEWI可作为一种新的保鲜技术，未来具有良好的应用前景。
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