5 类致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测方法的建立

doi:10.7506/spkx1002-6630-201822038

食品科学 ›› 2018, Vol. 39 ›› Issue (22): 249-255.doi: 10.7506/spkx1002-6630-201822038

5 类致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测方法的建立

胡安妥1,2，王娉1，张彩霞1,3，蔡阳1,4，陈颖1,*

（1.中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心，北京 100176；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏?南京 210023；3.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北?武汉 430070；4.吉林出入境检验检疫局，吉林?长春 130062）

出版日期:2018-11-25 发布日期:2018-11-21
基金资助:
“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0401102）；中国检验检疫科学研究院基本科研业务费项目（2016JK022）

Establishment of Multiplex Real-Time PCR Assay to Detect Five Strains of Diarrheagenic Escherichia coli

HU Antuo1,2, WANG Ping1, ZHANG Caixia1,3, CAI Yang1,4, CHEN Ying1,*

(1. Agro-Product Safety Research Center, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China;2. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China;3. College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430070, China;4. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China)

Online:2018-11-25 Published:2018-11-21

摘要/Abstract

摘要： 目的：建立快速检测和鉴别5?类致泻大肠埃希氏菌的多重实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）方法。方法：根据5?类致泻大肠埃希氏菌的11?组毒力基因eae、stx1、stx2、ipaH、uidA、estla、estlb、aggR、pic、elt、astA建立多重实时荧光PCR方法，该方法包括A、B?2?个反应体系，可分别检测肠致病性大肠埃希氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌、肠侵袭性大肠埃希氏菌、肠产毒大肠埃希氏菌、肠聚集性大肠埃希氏菌，优化反应体系的引物、探针浓度以及PCR反应条件，并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。结果：11?组基因的探针和引物均可特异性地扩增相应的基因片段，A体系检测下限可达到2.6×104?copies/反应，B体系检测下限可到达2.2×104?copies/反应。结论：本研究所建立的多重实时荧光PCR方法可以对同一样本同时采用A、B?2?个反应体系进行检测，不但可以确定待测样本是否为大肠埃希氏菌，而且还能判定其致病型别。为大肠埃希氏菌的临床检测、疾病预防以及爆发溯源等提供参考。

关键词: 致泻大肠埃希氏菌, 多重实时荧光PCR, 毒力基因

Abstract: Objective: To develop a multiplex real-time PCR method for rapid detection and identification of five strains of diarrheagenic Escherichia coli. Methods: The multiplex real-time PCR method was established based on 11 virulence genes, including eae, stx1, stx2, ipaH, uidA, estla, estlb, aggR, pic, elt and astA. This method consisted of two reaction systems, A and B, which could be used to detect diarrheagenic enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC), enterotoxigenic E. coli (EIEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), and enteroaggregative E. coli (EAEC), respectively. The concentrations of probe and primers and PCR reaction conditions were optimized, and the sensitivity and specificity of the method were finally tested. Results: The primers and probes specifically amplified 11 gene fragments, and the sensitivities of systems A and B were 2.6 × 104 and 2.2 × 104 copies/reaction, respectively. Conclusion: The multiplex real-time PCR method established in this study can be used to determine whether one sample is diarrheagenic E. coli and which type of pathogen it belongs to by the simultaneous use of reactions A and B. This method can provide a basis for clinical detection, disease prevention and outbreak traceability of diarrheagenic E. coli.

Key words: diarrheagenic Escherichia coli, multiplex real-time PCR, virulence gene

中图分类号:

R378.2

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HU Antuo, WANG Ping, ZHANG Caixia, CAI Yang, CHEN Ying. Establishment of Multiplex Real-Time PCR Assay to Detect Five Strains of Diarrheagenic Escherichia coli[J]. FOOD SCIENCE, 2018, 39(22): 249-255.

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5 类致泻性大肠埃希氏菌多重荧光PCR检测方法的建立

Establishment of Multiplex Real-Time PCR Assay to Detect Five Strains of Diarrheagenic Escherichia coli

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